摘要
木質(zhì)纖維素生物質(zhì)在單一反應(yīng)器中進(jìn)行水解和發(fā)酵的新型加工策略，為生物商品和生物燃料的生產(chǎn)提供了巨大的潛在成本節(jié)約。一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是在高產(chǎn)物濃度下保持高酶產(chǎn)量。為實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)，我們對纖維素分解、產(chǎn)乙醇的細(xì)菌Clostridium phytofermentans進(jìn)行了適應(yīng)高乙醇濃度的馴化。獲得的乙醇耐受性（ET）菌株的乙醇耐受性幾乎比野生型提高了一倍，但在低乙醇濃度下乙醇產(chǎn)量和生長速率均有所降低。ET菌株的基因組在涉及膜生物合成、Rnf復(fù)合物、陽離子穩(wěn)態(tài)、基因調(diào)控和乙醇生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中發(fā)生了編碼變化。特別地，對突變型雙功能乙醛輔酶A（CoA）/醇脫氫酶的純化表明，G609D變體使其活性（包括乙醇形成）喪失。在ET菌株中異源表達(dá)Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，增加了纖維素消耗并恢復(fù)了乙醇產(chǎn)量，證明了如何利用代謝工程來克服在乙醇適應(yīng)過程中產(chǎn)生的不利突變。我們討論了ET菌株的遺傳變化如何揭示了提高微生物溶劑耐受性的新的潛在策略。
木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料和商品是大規(guī)模、可再生的石油替代方案。這種多步生物轉(zhuǎn)化傳統(tǒng)上在一系列獨(dú)立的工藝中進(jìn)行，但整合生物加工（CBP）是一種具有潛在經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢的替代范式（1）。在CBP中，酶生產(chǎn)、水解和發(fā)酵在單個(gè)反應(yīng)器中發(fā)生，從而節(jié)省資本和運(yùn)營成本，并產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)（2）。我們研究了Clostridium phytofermentans，一種有前景的CBP候選菌，它能將植物生物質(zhì)主要發(fā)酵為乙醇（3, 4）。C. phytofermentans水解預(yù)處理過的玉米秸稈（包括葡聚糖和木聚糖）的效率，與使用商業(yè)酶和木糖發(fā)酵酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同時(shí)糖化共發(fā)酵（SSCF）相似（5）。C. phytofermentans發(fā)酵預(yù)處理過的玉米秸稈可達(dá)到7 g liter-1的乙醇濃度（6），而C. phytofermentans和S. cerevisiae cdt-1的穩(wěn)定共培養(yǎng)物可將約70 g liter-1的纖維素發(fā)酵為22 g liter-1的乙醇（7），該乙醇濃度會(huì)抑制C. phytofermentans的生長。因此，應(yīng)用C. phytofermentans等CBP細(xì)菌可能需要提高其溶劑耐受性，同時(shí)不損害酶生產(chǎn)或可溶性碳水化合物發(fā)酵為乙醇的能力。
大量努力集中在使梭菌適應(yīng)更高的溶劑水平，并研究與溶劑適應(yīng)相關(guān)的遺傳和生理變化（8-13）。其他研究表明，在主要產(chǎn)生乙醇以外發(fā)酵產(chǎn)物的梭菌中，乙醇產(chǎn)量得到提高。表達(dá)丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶（ADH）的C. celluloyticum克服了丙酮酸積累，并將發(fā)酵產(chǎn)物從乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜岷鸵掖迹?4）。在C. thermocellum中，通過丙酮酸激酶（15）重定向碳流、失活乳酸脫氫酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（16）以及刪除氫化酶（17）均能改善乙醇生產(chǎn)。這些結(jié)果表明，盡管基因工具現(xiàn)在才被開發(fā)出來，但在纖維素分解梭菌中工程化改進(jìn)乙醇生產(chǎn)是可能的。然而，開發(fā)既耐受乙醇又能高產(chǎn)乙醇的菌株仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。
本文中，我們試圖通過連續(xù)傳代到遞增的乙醇濃度中，開發(fā)一株具有提高乙醇耐受性的C. phytofermentans菌株，并表征其生長和發(fā)酵特性。我們對ET菌株基因組進(jìn)行了測序，以揭示適應(yīng)過程中出現(xiàn)的基因組突變，并通過異源表達(dá)替代乙醇形成途徑來克服ET菌株乙醇產(chǎn)量降低的問題。我們討論了本研究的結(jié)果如何增進(jìn)我們對微生物如何適應(yīng)乙醇等溶劑高濃度的理解。
材料與方法
培養(yǎng)。C. phytofermentans ISDg (ATCC 700394) 在Coy厭氧工作站中，在1.5% H2/98.5% N2氣氛下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)物在30°C、pH調(diào)整為7的GS2培養(yǎng)基（18）中靜置培養(yǎng)，并如文中所述補(bǔ)充碳源。生長動(dòng)力學(xué)通過密封的100孔微孔板（Bioscreen 9502550）中的600 nm光密度（OD600）監(jiān)測，如前所述（19）；每次光密度測量前，對培養(yǎng)物進(jìn)行短暫搖晃以重懸細(xì)胞。用于底物消耗和發(fā)酵產(chǎn)物分析的纖維素、纖維二糖和葡萄糖培養(yǎng)物在100-ml血清瓶中生長，脫氣后用丁基橡膠塞密封。
C. phytofermentans乙醇耐受性（ET）菌株通過連續(xù)傳代（1:50稀釋）到含有10 ml補(bǔ)充了遞增乙醇濃度的GS2培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中進(jìn)行篩選。從在4%（體積/體積）（31.5 g liter-1）乙醇中的培養(yǎng)物開始，每周傳代到含有相同乙醇濃度和乙醇濃度高1%的新鮮培養(yǎng)基中。如果在較高濃度下1周后未觀察到生長，則培養(yǎng)物重新傳代到相同的乙醇濃度。如果培養(yǎng)物在較高乙醇濃度下生長，則該培養(yǎng)物再次傳代到該乙醇濃度和高1%的乙醇濃度。在7次每周傳代后觀察到在5%乙醇中生長，13次傳代后在6%乙醇中生長，19次傳代后在7%乙醇中生長。每次乙醇耐受性提高時(shí)，將細(xì)胞鋪板，挑取單個(gè)菌落，并重新接種液體培養(yǎng)物，以確保選擇是基于一株具有提高的乙醇耐受性的特定菌株，而不是基于一個(gè)共同在提高的乙醇濃度下存活的菌株聯(lián)盟。因此，ET菌株是從在補(bǔ)充了7%（體積/體積）乙醇的GS2培養(yǎng)基中生長的母培養(yǎng)物中通過菌落純化分離得到的。經(jīng)菌落純化后，確認(rèn)ET菌株具有與母培養(yǎng)物相似的乙醇抗性。
纖維素和發(fā)酵分析。培養(yǎng)物中剩余的纖維素水平通過用無菌注射器從10-ml培養(yǎng)管中取1-ml樣品，放入預(yù)稱重的1.7-ml微量離心管中，在13,000 x g離心10分鐘進(jìn)行測量。去除上清液，纖維素沉淀被洗滌并再次在13,000 x g離心10分鐘。沖洗后的沉淀在70°C下干燥直至恒重。細(xì)胞生物量對總纖維素重量的貢獻(xiàn)未計(jì)入，并假設(shè)由于厭氧生物量產(chǎn)量低而最小。
發(fā)酵產(chǎn)物濃度在0.22 μm孔徑過濾的培養(yǎng)上清液中使用Agilent 1100高效液相色譜（HPLC）與Jasco RI-1531折射率檢測器（RID）和Aminex HPX-87H陽離子交換柱（Bio-Rad）進(jìn)行測量。HPLC運(yùn)行使用0.01 M硫酸流動(dòng)相，柱溫65°C，RID溫度30°C，樣品體積25 μl，操作流速0.6 ml/min。產(chǎn)物形成相對于接種時(shí)培養(yǎng)基中的濃度進(jìn)行報(bào)告。氣相測量通過抽取1 ml頂空并注入100 μl到氣相色譜儀（Model 8610C multiple-gas analyzer; SRI Instruments）中進(jìn)行。氬氣作為載氣，并調(diào)整至30 lb/in2 表壓。使用不銹鋼分子篩（13x）和硅膠填充柱進(jìn)行樣品分離，組分使用熱導(dǎo)檢測器（TCD）檢測。柱室溫度初始保持在40°C 3.5分鐘，然后程序升溫至160°C 2分鐘，再至300°C 10分鐘，之后讓柱冷卻至40°C直至樣品運(yùn)行結(jié)束。
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