2結(jié)果
2.1重組病毒的構(gòu)建及鑒定
DEV感染DEF細(xì)胞2 h后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染高純質(zhì)粒pT-UL56-RFP。轉(zhuǎn)染后約10 h，即可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有帶有紅色熒光的梭形細(xì)胞。72 h左右80%細(xì)胞出現(xiàn)病變，收獲病毒，凍融3次，用DEF細(xì)胞分離、純化紅色蝕斑，經(jīng)過5代篩選，獲得純化的重組病毒DEVΔ3513-RFP。
按照同樣的方法，去除RFP獲得了缺失UL56基因下游3 513 bp的重組病毒DEVΔ3513；用UL56基因下游3 513 bp替換病毒DEVΔ3513-RFP中的RFP，獲得了回復(fù)突變株DEVΔ3513(R)。經(jīng)測序鑒定，所構(gòu)建的3個重組病毒均正確。
2.2一步生長曲線
一步生長曲線結(jié)果表明，重組病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其親本毒均在接種后72 h，病毒含量達(dá)到峰值（106.2-6.5TCID50/0.1mL），隨后病毒含量下降（圖5）。表明UL56下游3 513 bp的缺失對DEV的復(fù)制沒有明顯影響，缺失后病毒滴度無顯著變化。
圖2重組病毒的一步生長曲線
2.3蝕斑大小分析
重組病毒及其親本毒均能在DEF細(xì)胞中形成清晰蝕斑；親本毒、DEV-Δ3513、DEV-Δ3513(R)蝕斑面積分別為（1.91±0.28）mm2、（1.82±0.31）mm2、（1.98±0.25）mm2，無顯著差異（＞0.05）（圖5-9），說明UL56基因下游3 513 bp缺失不影響DEV在細(xì)胞間的傳播能力。
圖3重組毒及其親本毒蝕斑面積
2.4致病性試驗
DEV親本毒、重組病毒DEV-Δ3513(R)在接種后3日麻鴨開始出現(xiàn)精神沉郁狀；7日全部死亡，剖檢肝臟表面有大量散在的白色壞死點(diǎn)。病理組織學(xué)觀察可見：靜脈和肝血竇淤血，充滿大量紅細(xì)胞；肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴呈空泡狀，發(fā)生脂肪變性；部分區(qū)域出現(xiàn)局灶性肝細(xì)胞壞死，在壞死區(qū)域伴有炎性細(xì)胞，胞核溶解，與其他研究結(jié)果一致。而DEV-Δ3513接種鴨和對照鴨在14 d觀察期內(nèi)，未出現(xiàn)任何臨床癥狀和死亡。病理組織學(xué)診斷可見肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯病理變化。說明UL56基因下游3 513 bp缺失后毒力明顯減弱。
2.5免疫原性測定
重組病毒DEVΔ3513以103.0TCID50/只、104.0TCID50/只劑量，免疫麻鴨后14 d，均能100%抵抗DEV強(qiáng)毒攻擊（表2），表明UL56基因下游3 513 bp缺失后仍具有良好免疫原性。
圖4肝臟病理切片（H.E.染色）
表2免疫后的攻毒保護(hù)效力
3討論
本研究以紅色熒光蛋白RFP為報告基因，以DEV參考強(qiáng)毒株為親本毒，通過同源重組，構(gòu)建了缺失UL56基因下游3 513 bp的重組病毒DEVΔ3513及其回復(fù)突變株DEVΔ3513(R)。并對其細(xì)胞生長特性、致病性和免疫原性進(jìn)行研究。體外試驗表明，重組病毒在細(xì)胞中的一步生長曲線、蝕斑大小與親本毒相似，說明UL56基因下游3 513 bp缺失不影響DEV在細(xì)胞上的生長，是病毒復(fù)制非必需基因。動物試驗結(jié)果表明，UL56基因下游3 513 bp缺失能顯著降低DEV的毒力，是DEV的一個毒力決定因子；缺失后仍保留良好的免疫原性，能抵抗致死性強(qiáng)毒攻擊，與現(xiàn)有商品化鴨瘟活疫苗免疫原性相當(dāng)。
表3免疫后的攻毒保護(hù)效力
我國鴨瘟活疫苗毒株，其親本毒于1957年從我國廣東分離，然后經(jīng)雞胚連續(xù)傳代60多代致弱。全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，與DEV參考強(qiáng)毒株相比，疫苗株基因組UL區(qū)5′端連續(xù)缺失了3 513 bp（2 716—6 228位核苷酸）導(dǎo)致UL56蛋白C端第215位氨基酸后移框變和UL55缺失。在α皰疹病毒中，除了牛皰疹病毒1型和5型外，均含有UL56同源物。UL56蛋白存在病毒粒子中。皰疹病毒UL56蛋白C端有一個疏水區(qū)，含跨膜區(qū)和多個PPxY基序等，為典型的跨膜錨定功能域。該功能域?qū)S持單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus 1，HSV-1）毒力表型具有重要作用。致病性HSV-1的UL56被LacZ替代后，腹膜內(nèi)注射不能引起樹熊發(fā)?。蝗醵綡SV-1 HFEM株UL56基因被強(qiáng)毒HSV-1 17株的UL56替換后，能恢復(fù)其毒力表型，進(jìn)一步研究表明，缺失UL56蛋白C末端疏水區(qū)（217—234位氨基酸）導(dǎo)致HSV-1毒力喪失。
本研究從DEV參考強(qiáng)毒與疫苗株基因組差異入手，分析了UL56基因下游3 513 bp對DEV參考強(qiáng)毒生物特性的影響，揭示了該區(qū)域?qū)S持DEV毒力發(fā)揮了重要作用。下一步將縮小缺失范圍，重點(diǎn)研究UL56蛋白C末端疏水區(qū)對DEV毒力的影響。
4結(jié)論
4.1重組病毒生長特性與親本毒相似，首次證明UL56基因下游3 513 bp對DEV在細(xì)胞中的復(fù)制是非必需的。
4.2缺失UL56基因下游3 513 bp能顯著降低DEV的毒力，首次證明是UL56基因下游3 513 bp是DEV的一個毒力決定因子。
4.3缺失UL56基因下游3 513 bp后仍保留良好的免疫原性。
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