材料和方法
細(xì)菌和噬菌體
使用胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）、胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白酶軟瓊脂（TSB + 0.4% 瓊脂）（Difco Laboratories, Detroit, MI）來培養(yǎng)宿主細(xì)菌和繁殖噬菌體。本研究中使用的細(xì)菌菌株是鮑氏志賀氏菌 C865-2（加拿大圭爾夫大學(xué)食品安全研究所（CRIFS），加拿大安大略?。?，用于噬菌體繁殖。其他細(xì)菌菌株列于表 1，來自 CRIFS 收藏（前綴為“C”的菌株）或 Nancy Strockbine（美國(guó)佐治亞州亞特蘭大疾病控制與預(yù)防中心國(guó)家傳染病中心細(xì)菌和真菌病部門）。
噬菌體的富集、分離和繁殖
從當(dāng)?shù)匚鬯幚韽S（加拿大安大略省圭爾夫）收集的污水樣本與等體積的 TSB 和 100μL 選定的志賀氏菌菌株混合的過夜培養(yǎng)物一起富集?；旌衔镌?30°C 下溫和搖動(dòng)培養(yǎng) 16-20 小時(shí)。孵育后，懸浮液在 4°C 下以 4000 x g 離心 15 分鐘（Beckman Avanti J-20 XPI, Beckman Coulter Inc., Mississauga, ON, Canada）。將上清液小心轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管中，并通過 0.45 um 孔徑的無菌一次性過濾器（Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada）過濾，并存儲(chǔ)在 4°C。
通過點(diǎn)樣試驗(yàn)檢測(cè)富集物中的噬菌體。簡(jiǎn)而言之，將 100μL 細(xì)菌過夜培養(yǎng)物加入 50-55°C 熔化的含有 0.4% 瓊脂糖的 4 mL TSB 中，混合后倒入 TSA（1.5% 瓊脂）平板，固化 15 分鐘。將過濾樣品的 10 uL 點(diǎn)樣到頂層軟瓊脂上，干燥 20 分鐘，然后在 25°C 下孵育 16-20 小時(shí)。
孵育后，檢查平板是否存在完全或部分裂解區(qū)；使用無菌接種環(huán)從 TSA 平板上切下這些區(qū)域，并分別放入 1 mL 的 λ-Ca2+ 噬菌體緩沖液（λ 緩沖液：2.5 g/L MgSO4·7H2O；0.05 g/L 明膠；6 mL/L 1 M Tris 緩沖液；pH 7.2）中。在 121°C 高壓滅菌 15 分鐘后，將過濾除菌的 CaCl2·2H2O 加入 λ 緩沖液至終濃度 5 mM。將管在室溫下放置過夜，讓噬菌體從軟瓊脂中擴(kuò)散出來。然后將混合物通過 0.45μm 膜過濾器（Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada）過濾以純化噬菌體。如先前所述，通過挑選單個(gè)噬菌斑并使用軟瓊脂覆蓋法純化分離的噬菌體。該過程重復(fù) 3 次以獲得純化的噬菌體。
使用 Bioscreen C 全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀確定宿主范圍
使用 Bioscreen C 全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀（Labsystems, Helsinki, Finland）通過測(cè)量測(cè)試細(xì)菌在噬菌體存在下的光密度（OD）來確定 AG3 對(duì) 29 種志賀氏菌菌株的宿主范圍。所有實(shí)驗(yàn)使用以下實(shí)驗(yàn)參數(shù)：?jiǎn)未?，寬波段（wb）波長(zhǎng)；25°C 孵育溫度；5 分鐘預(yù)熱時(shí)間；動(dòng)力學(xué)測(cè)量；測(cè)量時(shí)間 24 小時(shí)；每 20 分鐘讀取一次，每次測(cè)量前中等強(qiáng)度搖動(dòng) 10 秒。將五十微升噬菌體裂解液轉(zhuǎn)移到 Bioscreen C 全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀（Growth Curves USA, New Jersey, USA）的滅菌蜂窩板的 100 個(gè)孔中的每一個(gè)，每個(gè)孔接種 125μL 稀釋的測(cè)試細(xì)菌過夜培養(yǎng)物（約 10^8 CFU/mL）。感染復(fù)數(shù)（MOI）約為 100。對(duì)照孔包含僅噬菌體、僅噬菌體緩沖液或等體積噬菌體緩沖液與細(xì)菌。所有樣品進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)試。使用 Bioscreen C 數(shù)據(jù)處理軟件版本 5.26（Labsystems, Helsinki, Finland）分析 OD 數(shù)據(jù)以確定檢測(cè)時(shí)間（每個(gè)測(cè)試孔增加 0.3 OD 單位所需的時(shí)間）。將檢測(cè)時(shí)間（時(shí):分）轉(zhuǎn)換為十進(jìn)制值，取平均值，并從每個(gè)測(cè)試分離株的所有測(cè)試數(shù)據(jù)中減去平均對(duì)照檢測(cè)時(shí)間，表示為檢測(cè)時(shí)間差（DT diff.）。我們提出，基于此時(shí)間差，噬菌體的裂解活性可分為：（N）：噬菌體未引起測(cè)試細(xì)菌生長(zhǎng)的任何延遲，生長(zhǎng)曲線與對(duì)照相似；（D）：噬菌體引起測(cè)試細(xì)菌生長(zhǎng)延遲少于五小時(shí)；DT < 5 小時(shí)，（D+）：噬菌體引起測(cè)試細(xì)菌生長(zhǎng)延遲 5 小時(shí)或以上；DT ≥ 5 小時(shí)，和（C）：噬菌體在 24 小時(shí)后完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。
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