摘要以東北玉米主產(chǎn)區(qū)玉米莖腐病的主要病原菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）為研究對象，采用十字交叉法、干重法、生物學(xué)檢測法以及熒光免疫定量分析等研究方法，研究不同穩(wěn)定性有機(jī)磷源卵磷脂和植酸對禾谷鐮刀菌菌絲生長和致病力的影響。結(jié)果表明：卵磷脂能顯著促進(jìn)禾谷鐮刀菌生長，平板培養(yǎng)試驗(yàn)中，磷濃度為4.38 mmol/L時(shí)，卵磷脂組在生長第6天菌落直徑可達(dá)8.5 cm，而植酸組與K2HPO4組在培養(yǎng)第7天菌落直徑還未達(dá)到7 cm，生物量測定結(jié)果與之相符；不同有機(jī)磷不僅影響禾谷鐮刀菌的生長，還影響其代謝，磷濃度為43.8 mmol/L時(shí)，卵磷脂、植酸發(fā)酵培養(yǎng)液對玉米種子的萌發(fā)抑制率分別為56.7%和43.3%，分別為K2HPO4的3.4倍和2.6倍，發(fā)酵培養(yǎng)液中抑制玉米種子生長的物質(zhì)是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），其中卵磷脂組DON質(zhì)量濃度最高，為978.55μg/L，植酸次之，為580.79μg/L，二者顯著高于K2HPO4（104.51μg/L），且DON質(zhì)量濃度隨著磷濃度的增加而升高；利用有機(jī)磷產(chǎn)生DON毒素是禾谷鐮刀菌侵染玉米導(dǎo)致玉米莖腐病發(fā)生的主要致病機(jī)制，根據(jù)DON測定結(jié)果設(shè)置致病力試驗(yàn)，結(jié)果表明，以卵磷脂、植酸為磷源時(shí)，玉米苗期的發(fā)病率分別為98.33%和90.00%，病情指數(shù)分別為94和89，與K2HPO4（發(fā)病率76.66%，病情指數(shù)72）相比禾谷鐮刀菌致病力顯著提升。此外，還討論了土壤有機(jī)磷生物有效性及其影響因素對玉米莖腐病發(fā)生的影響。
禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是東北玉米主產(chǎn)區(qū)玉米莖腐病的主要致病菌。玉米莖腐病又稱莖基腐病或青枯病，是典型的土壤傳播病害。一般年份的發(fā)病率15%~20%，減產(chǎn)約20%，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)70%以上，產(chǎn)量損失約50%，已成為限制我國糧食產(chǎn)量的重要因素之一。不同學(xué)者從植物病理學(xué)的角度對該病原菌的種類、侵染規(guī)律、致病機(jī)理以及防治技術(shù)等進(jìn)行了廣泛而深入的研究，但近年來，隨著玉米重茬面積不斷增加，秸稈還田、免耕播種和密植技術(shù)的推廣應(yīng)用，玉米莖腐病的發(fā)病情況逐年加重。本研究對土壤主要有機(jī)磷（植酸和卵磷脂）對禾谷鐮刀菌生長及致病力的影響進(jìn)行研究，以期為耕地地力影響農(nóng)業(yè)有害生物發(fā)生的機(jī)制與調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考，為東北玉米主產(chǎn)區(qū)玉米莖腐病的防治提供理論依據(jù)。
土壤有機(jī)磷是土壤磷庫的重要組成部分，包括植酸、核酸、磷脂、磷蛋白、糖脂和其他磷酸鹽等。植酸類有機(jī)磷占土壤有機(jī)磷的40%~80%，對土壤肥力和植物營養(yǎng)的作用受到廣泛關(guān)注。按Bowman-Cole分級體系，土壤有機(jī)磷組分中，中活性有機(jī)磷（植酸及其鹽類）是構(gòu)成有機(jī)磷的主要組分，活性有機(jī)磷（核酸）所占有機(jī)磷的比例最小。與無機(jī)磷相比，有機(jī)磷具有在土壤中移動性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，土壤中磷素的移動絕大部分是有機(jī)磷形態(tài)，只有小部分可直接被植物根系吸收，其他必須經(jīng)過進(jìn)一步礦化為無機(jī)磷才能被植物吸收。由于土壤有機(jī)磷的礦化不僅通過磷素有效性而且還通過影響根際微生物的性質(zhì)影響植物的生長，因此，研究土壤有機(jī)磷對有害生物種群數(shù)量及其致病力的影響，對揭示不同地力因素與土傳病害發(fā)生的關(guān)系，為土傳病害防治措施提供理論依據(jù)具有重要意義。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1供試菌種
禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院高潔教授提供，分離于玉米莖腐病的病變組織。
1.1.2供試培養(yǎng)基
無磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基：硝酸鈉2.0 g，蔗糖30.0 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，純凈水1 000 mL，pH 7.0，配制固體培養(yǎng)基加18 g瓊脂；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC）。
1.1.3供試磷源
K2HPO4，植酸，卵磷脂。
1.1.4供試玉米品種
吉農(nóng)大58。使用無菌水和無磷培養(yǎng)基測試種子發(fā)芽率分別為98.00%和98.33%，兩組測試結(jié)果無顯著差別。
1.1.5盆栽試驗(yàn)試供試土壤
供試土壤為黑土，土壤基本理化性狀：含水量14.91%，有機(jī)碳15.26 g/kg，堿解氮89.12 mg/kg，有效磷16.43 mg/kg，速效鉀82.89 mg/kg，pH 6.73。
1.2不同有機(jī)磷源對禾谷鐮刀菌生長及代謝產(chǎn)物的影響
試驗(yàn)設(shè)置3種磷源（卵磷脂、植酸和K2HPO4），4個(gè)磷濃度梯度（0.043 8，0.438，4.38，43.8 mmol/L），總計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。
1.2.1不同磷源對禾谷鐮刀菌生長的影響
（1）十字交叉法：用滅菌打孔器在PDA培養(yǎng)基上打取經(jīng)活化培養(yǎng)的直徑為5 mm的禾谷鐮刀菌菌碟，分別接種在以卵磷脂、植酸、K2HPO4為唯一磷源的固體培養(yǎng)基上，對照為K2HPO4，置于25℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。每隔24 h進(jìn)行菌落直徑的測定，以其中一個(gè)處理長滿平皿結(jié)束測量。菌落實(shí)際直徑（cm）=測量直徑（cm）-0.5。
（2）干重法：將100 mL以卵磷脂、植酸、K2HPO4為唯一磷源的液體培養(yǎng)基分裝于250 mL錐形瓶內(nèi)，K2HPO4作為對照組，總計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。用打孔器在PDA培養(yǎng)基上打取直徑5 mm菌碟放入CMC液體培養(yǎng)基中，在25℃光照條件下振蕩培養(yǎng)（170 r/min）5 d。顯微鏡下觀察產(chǎn)生大量分生孢子后，發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)3層無菌紗布過濾掉菌絲，濾液經(jīng)1.0萬r/min離心10 min后收集孢子，加適量滅菌去離子水制成孢子懸浮。每個(gè)處理分別接種1 mL禾谷鐮刀菌的孢子懸液（2.0×106 CFU/mL，CFU為菌落數(shù)），25℃振蕩（170 r/min）培養(yǎng)5 d，離心（1×105 r/min）收獲菌絲，用無菌水反復(fù)清洗5次，105℃烘干至恒重后測定菌絲干質(zhì)量。生物量（菌絲質(zhì)量）=總質(zhì)量-定量濾紙質(zhì)量。
1.2.2不同磷源對禾谷鐮刀菌代謝產(chǎn)物的影響
（1）生測法：將上述培養(yǎng)液高速離心（1×105 r/min），取上清液（約100 mL），于121℃條件下滅菌20 min，冷卻后，取15 mL倒入鋪有雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，將經(jīng)過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液表面消毒后的玉米種子20粒整齊擺放其中，以無磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基離心上清液為對照，總計(jì)13個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后取出，分別測定種子萌發(fā)率，胚根和胚芽的長。萌發(fā)抑制率和胚根（胚芽）生長抑制率計(jì)算公式：萌發(fā)抑制率（%）=［（對照萌發(fā)率-毒素處理萌發(fā)率）/對照萌發(fā)率］×100；胚根（胚芽）生長抑制率（%）=［（對照平均長-處理平均長）/對照平均長］×100。
（2）代謝產(chǎn)物的鑒定：取上述經(jīng)高溫高壓滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)濾液1.0 mL于10 mL離心管中，加入5 mL提取液（體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液），使用漩渦混勻器振蕩5 min后，4 000 r/min離心1 min，取上清液。取100μL離心上清液加入1 000μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3~5 s，取100μL分別加入到DON毒素?zé)晒舛繖z測試紙條加樣孔中。置于37℃恒溫孵育器中溫育8 min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀（FD-600型，上海飛測生物科技有限公司）中讀數(shù)，讀數(shù)值即為樣品實(shí)際檢測濃度。每個(gè)樣品測3次，取平均值。
1.3不同有機(jī)磷源對禾谷鐮刀菌致病力的影響
采用盆栽幼苗傷口接種法。制備3種磷源（磷濃度為43.8 mmol/L）培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌制成的菌碟。以無菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，總計(jì)4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。
將采集的健康無病的玉米田黑土過3 mm（6目）篩，去除礫石和植物殘?bào)w后，按m（N）∶m（P）∶m（K）=29∶13∶10，0.06 kg/m2施肥水平將土壤與肥料混勻后，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間最大持水量的70%，裝盆，每盆2.5 kg。每個(gè)處理20盆，總計(jì)240盆。挑選子粒飽滿的玉米種子，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液表面消毒。待種子發(fā)芽后，種在育苗盆中，每盆種2株，于25℃光照培養(yǎng)室中培育，待玉米幼苗生長定植后，留健壯玉米苗1株，長至15 cm高時(shí)進(jìn)行致病菌接種。在莖基部用牙簽輕挑3個(gè)傷口，貼上菌碟后用保鮮膜纏繞包裹好，放回培養(yǎng)室中繼續(xù)保濕培養(yǎng)，5 d后觀察發(fā)病情況。
玉米苗期病害的病情級別分為4級：0級，健康，整株植株生長正常，未見任何發(fā)病；1級，輕度發(fā)病，玉米苗接種部位有輕微色變，沒有病斑產(chǎn)生；3級，中度發(fā)病，玉米植株莖基部發(fā)生顯著色變，出現(xiàn)少量病斑；5級，重度發(fā)病，接種部位變成褐色，病斑明顯。有些接種部位莖基完全潰爛，甚至造成植株死亡。發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算公式：
發(fā)病率（%）=（病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100；
病情指數(shù)=［∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級值）］×100。
1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法
采用Excel 2016和SPSS25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異性分析。
2結(jié)果與分析
2.1卵磷脂、植酸對禾谷鐮刀菌生長的影響
在十字交叉法培養(yǎng)試驗(yàn)中，根據(jù)每天菌落直徑的變化，繪制禾谷鐮刀菌生長曲線，見圖1，卵磷脂、植酸和K2HPO4菌落直徑隨時(shí)間變化均呈上升趨勢，說明禾谷鐮刀菌能利用3種磷源用于自身生長。在保證培養(yǎng)基中3種磷源磷的物質(zhì)的量濃度相等的條件下進(jìn)行比較，以卵磷脂為唯一磷源培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌菌落生長速度明顯快于對照組K2HPO4。當(dāng)培養(yǎng)基中磷濃度為4.38 mmol/L時(shí)，卵磷脂組在生長6 d菌落直徑已經(jīng)達(dá)到8.5 cm，而K2HPO4培養(yǎng)基在7 d時(shí)菌落直徑還未達(dá)到7.0 cm（圖1）?；A(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同磷源對禾谷鐮刀菌生長速度的影響見圖2?？梢?，植酸與K2HPO4之間無明顯差異，卵磷脂較K2HPO4相比更利于禾谷鐮刀菌菌落生長。
圖1基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同磷源對禾谷鐮刀菌生長的影響
圖2磷濃度為4.38 mmol/L培養(yǎng)基中禾谷鐮刀菌實(shí)際生長情況
土壤有機(jī)磷源卵磷脂和植酸對禾谷鐮刀菌菌絲生長和致病力的影響（一）
土壤有機(jī)磷源卵磷脂和植酸對禾谷鐮刀菌菌絲生長和致病力的影響（二）