變形鏈球菌形成生物膜和在酸性pH下存活的能力被認(rèn)為是齲齒發(fā)病機(jī)制中的兩個重要毒力決定因素。環(huán)境刺激被認(rèn)為通過雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的活性來調(diào)節(jié)幾種與毒力因子相關(guān)基因的表達(dá)。然而，關(guān)于這些系統(tǒng)在變形鏈球菌生理和致病性中的作用知之甚少。
在本研究中，我們描述了一個雙組分調(diào)控系統(tǒng)及其在變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性中的作用。通過使用肺炎鏈球菌的HK03和RR03蛋白序列作為查詢詞，在變形鏈球菌基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行tblastn搜索，我們鑒定出兩個基因，命名為hk11和rr11，它們分別編碼一個推定的組氨酸激酶及其同源應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。為了深入了解它們的功能，我們采用PCR介導(dǎo)的等位基因交換誘變策略，從變形鏈球菌野生型NG8中創(chuàng)建了hk11（Em?）和rr11（Em?）缺失突變體，分別命名為SMHK11和SMRR11。對這些突變體的生長速率、遺傳感受態(tài)、形成生物膜的能力以及對低pH挑戰(zhàn)的耐受性進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，刪除hk11或rr11會導(dǎo)致生物膜形成缺陷和對酸性pH的耐受性降低。兩種突變體形成的生物膜生物量減少（約為親本菌株密度的50%至70%）。
掃描電子顯微鏡觀察顯示，突變體形成的生物膜具有海綿狀結(jié)構(gòu)，其中似乎存在大的間隙，類似于水通道樣結(jié)構(gòu)。突變體的生物膜由比親本生物膜更長的細(xì)胞鏈組成。刪除hk11還導(dǎo)致對低pH的耐受性大大降低，盡管我們在刪除rr11時沒有觀察到相同的效果。兩種突變體的遺傳感受態(tài)均未受影響。結(jié)果表明，變形鏈球菌中hk11的基因產(chǎn)物可能作為pH傳感器，可以與一個或多個應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生交叉對話。我們得出結(jié)論，由hk11和rr11編碼的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)代表了一個參與變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性的新調(diào)控系統(tǒng)。
雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通過感知環(huán)境變化并調(diào)節(jié)基因表達(dá)以響應(yīng)各種刺激，在細(xì)菌適應(yīng)、生存和毒力中發(fā)揮作用。一個典型的雙組分調(diào)控系統(tǒng)包括一個膜相關(guān)的組氨酸激酶傳感器蛋白（感知特定的環(huán)境條件）和一個細(xì)胞質(zhì)應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（當(dāng)條件變化時通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)使細(xì)胞能夠響應(yīng)）。在受到特定配體或信號刺激時，組氨酸激酶傳感器蛋白在保守的組氨酸殘基處發(fā)生自身磷酸化。然后，磷酸基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到同源應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，后者進(jìn)而可以激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究表明，雙組分調(diào)控系統(tǒng)在多種細(xì)菌物種中調(diào)節(jié)多樣的代謝過程、細(xì)菌細(xì)胞周期、細(xì)胞間通訊和毒力因子。由于它們在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理、環(huán)境適應(yīng)和毒力表達(dá)方面的重要性，雙組分調(diào)控系統(tǒng)已被用作開發(fā)抗菌劑的目標(biāo)。
變形鏈球菌是一種進(jìn)化出生物膜生活方式以在其自然生態(tài)系統(tǒng)——牙菌斑中生存和持續(xù)存在的細(xì)菌。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，變形鏈球菌可以從膳食可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生足夠量的酸，并導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦-再礦化過程失衡，從而引發(fā)齲齒。變形鏈球菌引發(fā)齲齒的能力取決于幾個與毒力相關(guān)的特性，包括：（i）通過在其合成的不溶性細(xì)胞外多糖促進(jìn)下粘附并積聚在牙齒表面來啟動生物膜形成；（ii）高效分解碳水化合物并產(chǎn)酸；以及（iii）在低pH下生長和繼續(xù)代謝碳水化合物的能力。環(huán)境因素在調(diào)節(jié)變形鏈球菌這些毒力相關(guān)特性中起著重要作用。盡管有許多研究證明了環(huán)境刺激在調(diào)節(jié)變形鏈球菌生理和毒力特性方面的重要性，但關(guān)于變形鏈球菌響應(yīng)其環(huán)境波動而調(diào)節(jié)這些毒力特性表達(dá)的分子機(jī)制知之甚少。
我們最近在變形鏈球菌中描述了一個由雙組分系統(tǒng)（ComDE）組成的群體感應(yīng)信號系統(tǒng)。該系統(tǒng)響應(yīng)其天然信號肽信息素并激活許多對誘導(dǎo)遺傳感受態(tài)至關(guān)重要的基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致自然轉(zhuǎn)化。我們之前的工作表明，該系統(tǒng)似乎在變形鏈球菌的遺傳感受態(tài)、生物膜形成和酸耐受反應(yīng)中扮演全局調(diào)控角色。在本研究中，我們描述了一個新的雙組分調(diào)控系統(tǒng)，并開始評估該系統(tǒng)在變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性中的作用。
材料與方法
細(xì)菌菌株、培養(yǎng)基和化學(xué)品。 本研究使用的菌株及其相關(guān)特性列于表1。變形鏈球菌野生型菌株NG8常規(guī)在Todd-Hewitt酵母提取物瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，而突變體則在THYE瓊脂中加入10μg/ml紅霉素進(jìn)行維持。除非另有說明，常規(guī)使用THYE液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株。為了培養(yǎng)生物膜，制備了一種半限定最小培養(yǎng)基，該方法是對先前描述的方法的修改。該培養(yǎng)基含有58 mM K?HPO?、15 mM KH?PO?、10 mM (NH?)?SO?、35 mM NaCl和2 mM MgSO?·7H?O，并補(bǔ)充了過濾滅菌的維生素、氨基酸、0.2% Casamino Acids和20 mM葡萄糖。所有菌株的生物膜在聚苯乙烯微孔板中于SDM培養(yǎng)基中，37°C，5% CO?條件下培養(yǎng)16小時后進(jìn)行定量和顯微鏡檢查。
| 菌株/擴(kuò)增子/質(zhì)粒 | 相關(guān)特性 | 來源或參考文獻(xiàn) |
|---|---|---|
| 變形鏈球菌菌株 | ||
| NG8 | 野生型，Em?（紅霉素敏感） | A. S. Bleiweis，佛羅里達(dá)大學(xué) |
| SMHK11 | NG8△hk11::PcEm，Em?（紅霉素抗性） | 本研究 |
| SMRR11 | NG8△rr11::PcEm，Em? | 本研究 |
| 擴(kuò)增子 | ||
| PcEm | 帶有合成啟動子的Em?標(biāo)記，從ermAM盒擴(kuò)增 | 參考文獻(xiàn)4 |
| aHK11 | HK11-up::PcEm::HK11-dw，用于hk11的等位基因替換 | 本研究 |
| aRR11 | RR11-up::PcEm::RR11-dw，用于rr11的等位基因替換 | 本研究 |
| 質(zhì)粒 | ||
| pDL289 | 大腸桿菌-鏈球菌穿梭載體；Km?（卡那霉素抗性） | 參考文獻(xiàn)2 |
| 引物 | 核苷酸序列（5'→3'） | 擴(kuò)增子大?。╞p） |
|---|---|---|
| HK11-P1 | CTGAAGGAAGCCTTATGCG | 763 |
| HK11-P2 | GGCGCGCCCCGGAAATGATGGTAACTGCCG | - |
| HK11-P3 | GGCCGGCCAAGTGCTGAAAAGGGGG | 666 |
| HK11-P4 | CATAGACAACGGCTTGGGTC | - |
| RR11-P1 | AACGCCACCTCAACCAAA | 887 |
| RR11-P2 | GGCGCGCCGCCTCACCGATAACTTCTACATT | - |
| RR11-P3 | GGCCGGCCCCTTCAGCATCATTTAGTGCCAC | 565 |
| RR11-P4 | CACCCACATCCTCAAAGGTC | - |
| Em cst-P1 | GGCGCGCCCCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT | 860 |
| Em cst-P2 | GCTGGCCGGCCAGTCGGCAGCGACTCATAGAAT | - |
構(gòu)建hk11和rr11缺失突變體。 我們開始搜索俄克拉荷馬大學(xué)OU-ACGT網(wǎng)站的變形鏈球菌基因組數(shù)據(jù)庫，尋找在肺炎鏈球菌中鑒定出的13個TCSTSs的同源物。使用肺炎鏈球菌的HK03和RR03蛋白序列作為查詢詞進(jìn)行tblastn搜索，鑒定出兩個與肺炎鏈球菌的hk3和rr3基因同源的基因。這兩個基因被命名為hk11和rr11，分別編碼變形鏈球菌中一個推定的組氨酸激酶及其同源應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。本研究重點(diǎn)評估這個命名為HK/RR11的TCSTS在變形鏈球菌生物膜形成和酸耐受性中的功能。我們通過一個快速的基于PCR的缺失策略，在變形鏈球菌野生型菌株NG8中構(gòu)建了hk11和rr11基因的單獨(dú)缺失突變體，該策略涉及限制性內(nèi)切酶連接和等位基因替換，如先前所述。用于構(gòu)建和確認(rèn)基因缺失的引物列于表2。例如，為了構(gòu)建hk11突變體，使用引物HK11-P1和HK11-P2（其5'端含有一個AscI位點(diǎn)）從變形鏈球菌NG8基因組DNA中擴(kuò)增出hk11起始密碼子5'端的763 bp片段（HK11-up）。另一個擴(kuò)增子，命名為HK11-dw，是hk11 3'端的666 bp片段，使用HK11-P3（5'端帶有FseI位點(diǎn)）和HK11-P4引物擴(kuò)增。一個紅霉素抗性標(biāo)記PcEm（860 bp），來自合成的Em?盒，使用引物Em cst-P1和Em cst-P2（其5'端分別設(shè)計(jì)了AscI和FseI位點(diǎn)）進(jìn)行擴(kuò)增。這些擴(kuò)增子經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化和隨后的連接，產(chǎn)生HK11-up::PcEm::HK11-dw片段。連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化變形鏈球菌野生型菌株NG8，并借助合成的感受態(tài)刺激肽。通過雙交換同源重組后，hk11基因的內(nèi)部區(qū)域被紅霉素盒完全替換。使用類似的策略構(gòu)建rr11缺失突變體。
通過PCR確認(rèn)突變體中PCR構(gòu)建體的整合位點(diǎn)。簡而言之，通過先前描述的方法從在THYE-紅霉素（10μg/ml）瓊脂平板上選擇的轉(zhuǎn)化子中制備基因組DNA。然后使用突變體和野生型基因組DNA作為模板，用三種引物組合（P1和Em cst-P2，P4和Em cst-P1，以及P1和P4）進(jìn)行PCR，根據(jù)預(yù)測的產(chǎn)物大小驗(yàn)證構(gòu)建體正確重組到突變體基因組中。使用野生型（NG8）基因組DNA作為陰性對照。
生長速率。 在SDM培養(yǎng)基和補(bǔ)充了20 mM葡萄糖的胰蛋白胨-酵母提取物培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，使用Bioscreen微生物生長曲線分析儀（Bioscreen C Labsystems, Helsinki, Finland）和一次性多孔微孔板測定它們的生長動力學(xué)。Bioscreen配備了允許記錄濁度讀數(shù)并將其轉(zhuǎn)換為生長曲線的軟件。將等濁度的細(xì)胞懸浮液等分試樣（4μl）接種到每個含有400μl新鮮培養(yǎng)基的孔中。在總共20小時內(nèi)，每15分鐘短暫搖動后記錄培養(yǎng)物的濁度。每個樣品進(jìn)行三次重復(fù)測定，并使用三個無細(xì)胞的孔作為空白對照。
遺傳轉(zhuǎn)化。 為了確定hk11或rr11的失活是否對遺傳感受態(tài)的發(fā)展有任何影響，使用先前描述的方案檢測突變體的遺傳轉(zhuǎn)化能力。簡而言之，將過夜培養(yǎng)物用2 ml預(yù)溫的新鮮THYE肉湯（補(bǔ)充了5%馬血清）稀釋，生成1:20和1:40的稀釋液。將培養(yǎng)物在37°C、5% CO?條件下培養(yǎng)2小時，使?jié)岫冗_(dá)到600 nm處光密度為1.5至2.0單位。然后將每個樣品分成兩份：一份含有1μg/ml轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA（pDL289, Km?），另一份含有相同濃度的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA和新鮮制備的CSP（終濃度為500 ng/ml）。培養(yǎng)2至3小時后，輕輕超聲處理10秒以分散鏈球菌鏈，將細(xì)胞懸浮液等分試樣（100μl）涂布在含有卡那霉素（700 ng/ml）的THYE平板上。將適當(dāng)稀釋后的細(xì)胞懸浮液等分試樣也涂布在不含抗生素的THYE平板上以確定總受體細(xì)胞數(shù)。親本菌株NG8的轉(zhuǎn)化作為陽性對照。轉(zhuǎn)化頻率表示為每毫升細(xì)胞懸浮液中轉(zhuǎn)化子數(shù)除以總受體細(xì)胞數(shù)。