2.9噬菌體A149的治療評價
按照圖7A的流程進行噬菌體A149對小鼠腸道VRE定殖的治療；對治療后小鼠糞便中的腸球菌進行計數(shù)以評價A149的治療效果，結果如圖7B所示，經(jīng)過混合抗生素處理和V583感染后，V583可在小鼠腸道實現(xiàn)短期穩(wěn)定的定殖(第1、2天)，糞便中腸球菌載量可達109 CFU/g左右。在使用噬菌體A149治療之后，治療組與對照組(BHI處理)在2 d后(第3、4天)均有顯著差異，治療組在第二天可降低1.3個數(shù)量級的V583載量。但V583不能繼續(xù)在對照組的小鼠腸道中實現(xiàn)高載量的穩(wěn)定定殖，在V583感染后第5?7天發(fā)生顯著降低；治療組與對照組在第5?7天的細菌載量無顯著性差異。該結果證實A149可在感染初期有效降低V583在小鼠腸道中的定殖。
圖7噬菌體A149對小鼠腸道VRE感染的治療評價A：噬菌體A149對小鼠腸道VRE感染的治療流程圖。?12、?10、?9、?3分別表示耐萬古霉素Efs V583感染前12 d、10 d、9 d以及3 d。Abx為AntiBiotics簡稱。B：噬菌體A149治療后糞便中的糞腸球菌計數(shù)。
小結
噬菌體A149基因組不含抗生素抗性基因和毒力基因，在體外可有效抑制糞腸球菌生長達11 h，對所測試的糞腸球菌具有86.4%的裂解能力(51/59)，在小鼠腸道感染模型中可降低糞腸球菌約1.3個數(shù)量級。
3、討論
多重耐藥性腸球菌的感染是當前臨床上一個突出的治療挑戰(zhàn)，其中，院內感染最為常見的腸球菌是屎腸球菌和糞腸球菌。相較于屎腸球菌，糞腸球菌的毒力往往更強，引起菌血癥的同時也可能伴有心內膜炎[18]。因此，耐藥糞腸球菌尤其是耐萬古霉素糞腸球菌的感染嚴重威脅著人類健康和公共衛(wèi)生安全。噬菌體作為一種歷史悠久的天然抗菌劑，在后抗生素時代再次受到人們的重視，在治療多重耐藥菌感染的方面具有巨大的應用潛力；已有臨床案例證實，噬菌體可成功治療多重耐藥性細菌感染[19]。目前，國內外對糞腸球菌噬菌體的研究相對有限，亟須進一步篩選和研究其噬菌體的生物學特性，為建立糞腸球菌感染的噬菌體防控策略提供科學基礎。
本研究分離出一株針對耐萬古霉素糞腸球菌V583的噬菌體A149，其最佳感染復數(shù)為0.001，潛伏期短(≤5 min)，暴發(fā)量高(約912 PFU/cell)，在生長特性上優(yōu)于之前報道的腸球菌短尾噬菌體Ideix和vB_EfaP_IME195[9,20]。A149可在較寬的溫度范圍(20?50℃)和pH范圍(4.0?10.0)穩(wěn)定存活，基因組不含抗生素抗性基因和毒力基因，具有應用于治療糞腸球菌感染的潛力。此外，A149對糞腸球菌菌株的裂解譜為86.4%(51/59)，在種內具有良好的廣譜性；對屎腸球菌(0/5)、單核增生李斯特氏菌(0/2)、金黃色葡萄球菌(0/2)和大腸桿菌(0/2)等均無裂解效果，具有良好的特異性。一般認為，短尾噬菌體的裂解譜較肌尾噬菌體(Myoviridae)和長尾噬菌體(Siphoviridae)窄[21]，但噬菌體A149表現(xiàn)出相對較廣的裂解譜，有研究也表明腸球菌短尾噬菌體Ump比肌尾噬菌體CCS1和長尾噬菌體CCS2、CCS3、CCS4表現(xiàn)出更廣泛的裂解譜[22]，表明腸球菌短尾噬菌體的裂解譜可能相對較廣。
VRE腸道定殖是住院患者院內感染的主要來源，因此我們模擬住院患者抗生素治療后耐藥腸球菌大量增殖造成腸道感染的特征構建了小鼠模型，并測定了噬菌體A149對VRE腸道定殖的清除效果。相較于對照組，A149在治療后第2天可顯著降低V583定殖，減少約1.3個數(shù)量級，具有良好的體內治療效果。但A149并未實現(xiàn)對腸道內V583的完全清除，噬菌體抗性菌的產(chǎn)生是其中的一個原因，體外抑菌曲線也顯示在11 h之后抗性菌開始進入生長期(圖6)。有研究表明噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生是噬菌體不能根除腸球菌腸道感染的原因之一[23]，證實了噬菌體抗性菌株是噬菌體療法的局限性之一。本研究中的糞腸球菌V583是耐萬古霉素糞腸球菌，所以具有抗生素和噬菌體雙重抗性的細菌可能已被選擇出來，并成為優(yōu)勢感染的菌群，進一步增加了治療難度。有研究表明，一些耐藥菌株在獲得噬菌體抗性的同時會出現(xiàn)對部分抗生素的再次敏感，因此噬菌體與抗生素的聯(lián)合使用具有協(xié)同抗菌作用，是一種值得探究的聯(lián)合抗菌策略[24]。此外，噬菌體“雞尾酒”療法通過復配不同類型或不同受體的噬菌體形成組合，可以在一定程度上有效消除噬菌體抗性，并具備比單株噬菌體更強的殺菌能力，是噬菌體療法的主要研究方向之一[25]。今后的研究應致力于篩選更多的糞腸球菌噬菌體，并開發(fā)高效、廣譜的噬菌體“雞尾酒”療法，為耐藥糞腸球菌感染的防控提供新的策略。
4、結論
本研究從污水樣本中分離出一株可高效裂解耐萬古霉素糞腸球菌V583的短尾噬菌體A149，經(jīng)過對其形態(tài)學觀察、生物學特性研究以及體內外抑菌實驗，表明該噬菌體具有較廣的裂解譜以及較好的抑菌作用，是治療耐萬古霉素糞腸球菌的有效生物資源，對于糞腸球菌感染的“無抗”防控具有重要的意義。
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