3.結(jié)果
3.1分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果
499份腹瀉樣品中檢出PEDV陽(yáng)性162份，陽(yáng)性率為35.2%。S基因測(cè)序分析顯示，21株流行毒株間核苷酸同源性為96.9%～100%，氨基酸同源性為95.2%～100%；與2011–2019年國(guó)內(nèi)流行毒株相比，核苷酸同源性為95.1%～99.5%，氨基酸同源性為91%～99.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所有毒株均聚集于GIIb亞群，且S蛋白存在7個(gè)規(guī)律性氨基酸突變位點(diǎn)（如N347D、S553T等），提示病毒持續(xù)進(jìn)化。
3.2病毒分離與鑒定結(jié)果
成功從陽(yáng)性樣品中分離獲得兩株P(guān)EDV：CHHNKF03（2020年）和CHHNPDS01（2021年）。RTPCR和IFA檢測(cè)均為陽(yáng)性，透射電鏡下可見(jiàn)典型冠狀病毒顆粒，直徑約100–160 nm，表面有棒狀突起。全基因組序列分析顯示，兩株病毒全長(zhǎng)約28,033 bp，與GIIb群參考株核苷酸同源性為95.6%～98.7%，確認(rèn)為當(dāng)前主流變異株。
3.3病毒滴度與生長(zhǎng)曲線測(cè)定（核心結(jié)果）
（1）基礎(chǔ)病毒滴度
CHHNKF03株：TCID??=10?.?/0.1 mL
CHHNPDS01株：TCID??=10?.?/0.1 mL
（2）體外復(fù)制動(dòng)態(tài)（生長(zhǎng)曲線）
圖1.PEDV CHHNKF03與CHHNPDS01株體外復(fù)制動(dòng)態(tài)（生長(zhǎng)曲線）
（注：橫軸為感染后時(shí)間/h，縱軸為病毒滴度log??TCID??/0.1 mL，兩條曲線分別代表兩株病毒的滴度變化趨勢(shì)，峰值點(diǎn)清晰標(biāo)注）
如圖1所示，兩株病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制曲線呈現(xiàn)典型S型增長(zhǎng)：
CHHNKF03株：感染后6 h病毒滴度為102.?TCID??/0.1 mL，12 h升至103.?，18 h達(dá)10?.?，24 h達(dá)到峰值10?.?TCID??/0.1 mL，30 h略有下降至10?.?，36 h為10?.?。
CHHNPDS01株：6 h為102.3，12 h為103.?，18 h為10?.?，24 h為10?.?，30 h達(dá)峰值10?.?TCID??/0.1 mL，36 h降至10?.?。
>結(jié)論：CHHNKF03株復(fù)制速度更快，潛伏期短，在24 h即達(dá)最大滴度；而CHHNPDS01株復(fù)制略慢，但峰值維持時(shí)間較長(zhǎng)。該差異可能與其基因組非結(jié)構(gòu)蛋白或S蛋白變異有關(guān)，提示在疫苗生產(chǎn)中需根據(jù)毒株特性設(shè)定最佳收毒時(shí)間。
（3）不同MOI對(duì)CHHNKF03株復(fù)制的影響
MOI=0.1、0.03、0.01：病毒滴度在24 h達(dá)到峰值（約10?.?TCID??/0.1 mL）
MOI=0.006、0.002：滴度在30 h達(dá)峰（約10?.?TCID??/0.1 mL）
綜合病毒產(chǎn)量與接種成本，確定最佳感染復(fù)數(shù)為MOI=0.01，最佳收毒時(shí)間為感染后24 h。
（4）收毒方式比較
比較“僅上清液”與“上清+細(xì)胞凍融”兩種方式，后者病毒滴度高出約0.5–1.0 log，表明細(xì)胞內(nèi)存在大量未釋放病毒粒子，推薦采用“上清與細(xì)胞混合液反復(fù)凍融”方式收毒。
3.4致病性驗(yàn)證（仔豬回歸試驗(yàn)）
人工感染1日齡無(wú)母源抗體仔豬，兩株病毒均引起100%發(fā)病率和100%死亡率，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重水樣腹瀉、脫水、衰竭，病理剖檢見(jiàn)小腸擴(kuò)張、腸壁變薄，符合PED典型癥狀，證實(shí)為強(qiáng)毒株。
3.5滅活疫苗研制與免疫效果
（1）佐劑篩選
Freemix水性佐劑配苗后，免疫豬群抗體水平（ELISA）和中和抗體滴度均顯著高于油佐劑和鋁膠組，且局部反應(yīng)小，確定為首選佐劑。
（2）攻毒保護(hù)試驗(yàn)
CHHNKF03滅活疫苗組：保護(hù)率80%（4/5存活）
商品化滅活疫苗組：保護(hù)率60%（3/5存活）
DMEM對(duì)照組：保護(hù)率20%（1/5存活）
免疫組仔豬腹瀉癥狀明顯減輕，死亡時(shí)間延遲，表明自研疫苗具有更優(yōu)的交叉保護(hù)效果。
4.討論
本研究系統(tǒng)揭示了河南省PEDV流行毒株的分子流行病學(xué)特征與生物學(xué)行為。35.2%的高陽(yáng)性率提示PEDV在本地仍廣泛傳播。所有毒株均屬GIIb群，且S蛋白出現(xiàn)新突變，可能影響抗原性與宿主適應(yīng)性，解釋了現(xiàn)有疫苗保護(hù)力下降的原因。
生長(zhǎng)曲線測(cè)定是本研究的核心環(huán)節(jié)之一。結(jié)果顯示，CHHNKF03株具有更快的復(fù)制速度和更高的峰值滴度，適合用于疫苗生產(chǎn)。其在MOI=0.01、24 h收毒時(shí)產(chǎn)量最高，為規(guī)?；囵B(yǎng)提供了關(guān)鍵參數(shù)。相比之下，CHHNPDS01株雖滴度略低，但其持續(xù)復(fù)制能力可能反映更強(qiáng)的適應(yīng)性，值得進(jìn)一步研究。
基于CHHNKF03株研制的滅活疫苗在動(dòng)物試驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)于商品化疫苗的保護(hù)效果，可能得益于其抗原與當(dāng)前流行株高度匹配。Freemix佐劑的應(yīng)用也提升了免疫應(yīng)答水平。
5.結(jié)論
1.河南省PEDV流行率較高（35.2%），當(dāng)前流行毒株主要為GIIb亞群，S基因持續(xù)發(fā)生變異；
2.成功分離CHHNKF03和CHHNPDS01兩株強(qiáng)毒，其體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)存在差異，CHHNKF03株在24 h達(dá)滴度峰值（10?.?TCID??/0.1 mL），為疫苗生產(chǎn)最佳收毒時(shí)間點(diǎn)；
3.基于CHHNKF03株研制的滅活疫苗免疫效果良好，仔豬攻毒保護(hù)率達(dá)80%，具備推廣應(yīng)用潛力；
4.本研究為PEDV的精準(zhǔn)防控、疫苗更新及病毒復(fù)制機(jī)制研究提供了重要數(shù)據(jù)支持。
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