2 結(jié)果與分析
2.1 產(chǎn)香酵母的分離純化
參照《真菌鑒定手冊(cè)》和《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，對(duì)分離純化出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定。酵母菌菌落多數(shù)呈乳白色，極少數(shù)為紅色，個(gè)別為黑色。酵母菌的菌落表面大多數(shù)光滑、濕潤(rùn)、黏稠，容易被挑起；小部分干燥、覆蓋有細(xì)小絨毛，難以挑取。酵母菌的菌體形態(tài)各樣，包括球狀、卵圓形、橢球形、柱狀、香腸狀等。通過(guò)對(duì)酵母菌菌落特征觀察和染色鏡檢，確定出16株具有典型酵母特征的菌株，其菌落、菌體形態(tài)和酵母菌形態(tài)學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)表2。
2.2 產(chǎn)香酵母的初篩
嗅聞YPD固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的酵母菌氣味，產(chǎn)香酵母風(fēng)味篩選結(jié)果見(jiàn)表3：不同產(chǎn)香酵母菌株的氣味及強(qiáng)度有明顯差異，R05、R07、R13無(wú)明顯風(fēng)味；R03、R04、R12、R14、R15風(fēng)味強(qiáng)度較弱，表現(xiàn)為淡淡的酯香和醇香；R01、R02、R06、R08、R09、R10、R11、R16具有較濃厚的酯香、醇香、果香和蜜香，香氣宜人。綜上，初篩出R01、R02、R06、R08、R09、R10、R11、R16產(chǎn)香酵母菌株進(jìn)行下一步復(fù)篩。
2.3 產(chǎn)香酵母的復(fù)篩
酯類(lèi)是產(chǎn)香酵母代謝產(chǎn)生的主要風(fēng)味物質(zhì)，測(cè)定不同產(chǎn)香酵母發(fā)酵液的總酯含量，結(jié)果如圖1所示：8株產(chǎn)香酵母的產(chǎn)酯能力均有差異，其中R09和R10發(fā)酵液的總酯含量明顯相對(duì)較低，說(shuō)明這2株酵母的產(chǎn)香、產(chǎn)酯能力相對(duì)較差；其中R01、R02、R06、R08、R11、R16發(fā)酵液的總酯含量較高，分別達(dá)到14.13、18.78、18.21、15.13、15.92、20.88 mg/L，說(shuō)明這6株酵母的產(chǎn)香、產(chǎn)酯能力相對(duì)更佳。綜上，復(fù)篩出R01、R02、R06、R08、R11、R16產(chǎn)香酵母菌株進(jìn)行下一步分子生物學(xué)鑒定。
表2 酵母菌形態(tài)學(xué)分析結(jié)果
2.4 產(chǎn)香酵母的分子生物學(xué)鑒定
不同產(chǎn)香酵母菌株P(guān)CR擴(kuò)增電泳圖如圖2所示：條帶亮度較高，無(wú)拖尾現(xiàn)象，完整性較好，表明PCR產(chǎn)物可用于菌株序列測(cè)定。擴(kuò)增產(chǎn)物于生物公司測(cè)序后利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，不同產(chǎn)香酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示，結(jié)果表明：6株產(chǎn)香酵母中R01、R02、R11與Wickerhamomyces anomalus（NG062034.1）同源性最高，相似度分別達(dá)到98.96%、99.43%、99.81%，可推斷R01、R02、R11為異常威克漢姆酵母；R06、R08與Hanseniaspora guilliermondii（NG063249.1）同源性最高，相似度分別達(dá)到99.24%、99.14%，可推斷R06、R08為季也蒙有孢漢遜酵母；R16與Saccharomycopsis fibuligera（NG065156.1）同源性最高，相似度達(dá)到99.44%，可推斷R16為扣囊復(fù)膜酵母。
2.5 產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)曲線
不同產(chǎn)香酵母菌株的生長(zhǎng)曲線如圖4所示，結(jié)果表明：6株產(chǎn)香酵母的延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期存在較大差異，R02、R08和R11的延滯期最短，為6–10 h，在15 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期；R06較其他菌株生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，延滯期為25 h，在極35 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。6株產(chǎn)香酵母的最大菌體濃度也具有差異，其中R08能達(dá)到的最大菌體濃度最低。
表3 產(chǎn)香酵風(fēng)味篩選結(jié)果
圖1 不同產(chǎn)香酵母發(fā)酵液中總酯。不同產(chǎn)香酵母發(fā)酵液中總酯含量的差異用字母表示，不具有相同字母表示差異顯著（P < 0.05）。
圖2 不同產(chǎn)香酵母菌株P(guān)CR擴(kuò)增電泳圖。
圖3 不同產(chǎn)香酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
圖4 不同產(chǎn)香酵母菌株的生長(zhǎng)曲線。
2.6 產(chǎn)香酵母的耐受性
二氧化硫是極果酒發(fā)酵常用的抑菌劑和防腐劑，研究不同產(chǎn)香酵母菌株對(duì)二氧化硫的耐受性，結(jié)果如圖5a所示：在100–300 mg/L的二氧化硫含量條件下，6株酵母的OD值相對(duì)平穩(wěn)；超過(guò)300 mg/L時(shí)，OD值呈現(xiàn)微弱下降趨勢(shì)；在500 mg/L的二氧化硫含量條件下，OD值均還高于5.481 5。
選擇7% vol的酒精度為最低乙醇耐受度，研究不同產(chǎn)香極酵母菌株對(duì)酒精度的耐受性，結(jié)果如圖5b所示：R06、R08在酒精度為7% vol時(shí)不能生長(zhǎng)；R01、R11在酒精度為9% vol時(shí)均能正常生長(zhǎng)，酒精度達(dá)到11% vol時(shí)不能生長(zhǎng)；極R02、R16在酒精度為9% vol時(shí)能正常生長(zhǎng)，酒精度達(dá)到11% vol時(shí)菌體濃度急劇下降，但能繼續(xù)生長(zhǎng)。
初始糖度會(huì)影響果酒發(fā)酵的酒精度，初始糖度越高，酒精度就相對(duì)越高，研究不同產(chǎn)香酵母菌株對(duì)糖度的耐受性，結(jié)果如圖5c所示：6株產(chǎn)香酵母隨著初始糖度的增大，其OD值均有不同程度的降低。隨著初始糖度的提高，R01、R02、R11、R16的OD值維持在較高水平且趨于穩(wěn)定；R06、R08的OD值下降較為明顯，R06最為明顯。
溫度影響酵母菌生長(zhǎng)，高溫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝活動(dòng)能力下降，選擇在20–36 ℃范圍內(nèi)培養(yǎng)產(chǎn)香酵母48 h，研究不同產(chǎn)香酵母菌株對(duì)溫度的耐受性，結(jié)果如圖5d所示：在20–28 ℃時(shí)，6株產(chǎn)香酵母的OD值呈上升趨勢(shì)，到28 ℃達(dá)到最高，說(shuō)明它們的最適生長(zhǎng)溫度是28 ℃；而在28–36 ℃時(shí)，6株產(chǎn)香酵母的OD值呈下降趨勢(shì)；在36 ℃，除了R08，其他均還能保持較高的OD值（> 5.481 5），說(shuō)明它們具有較高的溫度耐受性。
結(jié)合產(chǎn)香酵母分子學(xué)生物鑒定、生長(zhǎng)曲線以及耐受性分析結(jié)果，綜合考慮選擇R02、R16菌株分別與釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵果酒，探究產(chǎn)香酵母混菌發(fā)酵在果酒中的應(yīng)用。
2.7 產(chǎn)香酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵果酒的感官
感官評(píng)價(jià)是評(píng)定果酒品質(zhì)的重要極指標(biāo)，選擇R02、R16分別與釀酒酵母混菌發(fā)酵梨酒、獼猴桃酒、蘋(píng)果酒，對(duì)果酒的澄清度、典型性、滋味、平衡性、濃郁度和色澤6個(gè)方面進(jìn)行感官分析以及與釀酒酵母單菌發(fā)酵果酒進(jìn)行綜合對(duì)比，結(jié)果如圖6所示：在3種果酒中，R02、R16混菌發(fā)酵果酒均相對(duì)于釀酒酵母單菌發(fā)酵果酒在典型性、滋味、平衡性、濃郁度4個(gè)方面有顯著提升，其中在典型性、滋味方面提升最為顯著。綜上所述，R02與釀酒酵母混菌發(fā)酵和R極16與釀酒酵母混菌發(fā)酵果酒均能有效提升果酒的感官品質(zhì)，但在不同原料的極果酒各有側(cè)重，主要從果酒的典型性和滋味來(lái)看，R16與釀酒酵母混菌發(fā)酵梨酒、蘋(píng)果酒較R02表現(xiàn)更突出，R02與釀酒酵母混菌發(fā)酵獼猴桃酒較R16表現(xiàn)更突出。
2.8 產(chǎn)香酵母混菌發(fā)酵果酒的理化指標(biāo)
根據(jù)GB/T 15038-2006和《葡萄酒、果酒通用分析方法》，測(cè)定釀酒酵母單菌發(fā)酵、R02與釀酒酵母發(fā)酵、R16與釀酒酵母混菌發(fā)酵釀造的獼猴桃酒、梨酒、蘋(píng)果酒的理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表4。R02、R16混菌發(fā)酵的果酒，其酒精度、還原糖含量、總酸含量均能符合果酒釀造的生產(chǎn)需要。相對(duì)酵母單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵的獼猴桃酒的還原糖殘?zhí)秋@著提高，其他變化不明顯；混菌發(fā)酵的梨酒的總酸含量均顯著上升，還原糖殘?zhí)呛可燥@降低，酒精度變化不明顯；R02混菌發(fā)酵的蘋(píng)果酒的酒精度稍顯提高，其他變化不顯著。綜上，菌株R02和R16可作為果酒釀造的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)香酵母，在果酒釀造的生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景。
3 討論與結(jié)論
本研究從新鮮的果皮、枝梗和大曲中共分離出16株具有典型酵母特征的菌株。經(jīng)嗅聞法初篩、總酯測(cè)定復(fù)篩和分子生物學(xué)鑒定為6株產(chǎn)香酵母，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)R01、R02、R11為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；R06、R08為季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）；R16為扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）。
圖5 不同產(chǎn)香酵母菌株耐受性分析。a：二氧化硫；b：酒精度；c：初始糖度；d：溫度。同一菌株在單因素變量下OD值的差異用符號(hào)表示，其中R16菌株用小寫(xiě)英文字母表示，R08用數(shù)字表示，R06用大寫(xiě)英文字母表示，R01用希臘字母表示，R02用羅馬數(shù)字表示，R11用漢字表示，不具有相同符號(hào)表示差異顯著（P < 0.05）。
圖6 產(chǎn)香酵母混菌發(fā)酵不同果酒感官分析雷達(dá)圖。a：梨酒；b：獼猴桃酒；c：蘋(píng)果酒。
蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）；R16為扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）。在產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)特性研究中，延滯期短，說(shuō)明酵母菌代謝速率加大，增殖速率加快。研究表明，5株產(chǎn)香酵母（R01、R02、R11、R08、R16）均具有較短的延滯期（6–15 h），適合果酒發(fā)酵，這與報(bào)道果酒發(fā)酵的產(chǎn)香酵母的延滯期相似。而果酒生產(chǎn)中，使用一定量的二氧化硫能夠產(chǎn)生殺菌、抗氧化以及增加酸度等作用，本研究篩選的6株產(chǎn)香酵母菌均具有較高的二氧化硫耐受性，能在二氧化硫（<250 mmol/L）產(chǎn)生殺菌效果的環(huán)境中生長(zhǎng)。糖在果酒中是發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的主要來(lái)源和酵母生長(zhǎng)的能源物質(zhì)，但是高濃糖環(huán)境對(duì)酵母生長(zhǎng)繁殖有抑制作用，高滲透壓會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞水分流失，4株酵母菌（R01、R02、R11、R16）均具有較高的糖耐受性，適合果酒發(fā)酵環(huán)境。最關(guān)鍵的是，在果酒發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)繁殖會(huì)隨著酒精度的升高而受到抑制，而本研究中的2株酵母（R02和R16）表現(xiàn)出很好的耐受性，在高達(dá)11%vol的酒精度下還能生長(zhǎng)，比較適合果酒（10%vol–15%vol）的發(fā)酵環(huán)境。綜合考慮，本研究選擇R02和R16進(jìn)行了后續(xù)與釀酒酵母的混菌發(fā)酵。從感官評(píng)價(jià)看，R16能顯著提升果酒的平衡性和濃郁度，R02能顯著提升果酒的典型性和滋味。而從理化評(píng)價(jià)可知，梨酒總酸升高（約44%），這可能與報(bào)道的異常威克漢姆酵母（R02）和扣囊復(fù)膜酵母（R16）具有較高的產(chǎn)酸能力相關(guān)；蘋(píng)果酒無(wú)明顯提升；獼猴桃還原糖殘?zhí)呛吭黾樱s213%），這可能與異常威克漢姆酵母（R02）能夠分泌β-D-葡萄糖苷酶、β-D-木糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶等多種糖苷酶，促進(jìn)非發(fā)酵單糖（木糖、鼠李糖）的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致果酒還原糖殘?zhí)呛康纳摺?
本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和嗅聞法初篩、發(fā)酵液總酯測(cè)定復(fù)篩、分子生物學(xué)鑒定，從新鮮果皮、枝梗和大曲樣品中，篩選到兩株優(yōu)異的產(chǎn)香酵母，分別為異常威克漢姆酵母（R02）和扣囊復(fù)膜酵母（R16），它們具有較短的延滯期和較高的二氧化硫、酒精度、糖度以及溫度耐受性。通過(guò)進(jìn)一步與釀酒酵母混菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)R02、R16與釀酒酵母混菌發(fā)酵極果酒均能有效提升果酒的感官品質(zhì)，其中R16混菌發(fā)酵能顯著提高梨酒中總酸含量，提升梨酒的平衡性和濃郁度；而R02混菌發(fā)酵能顯著提高獼猴桃酒中還原糖殘?zhí)呛?，提升果酒的典型性和滋味。因此，本研究篩選得到的異常威克漢姆酵母（R02）和扣囊復(fù)膜酵母（R16）均是果酒釀造的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)香酵母，在果酒的生產(chǎn)釀造中具有較好的應(yīng)用前景。在后續(xù)研究中，將深入探究產(chǎn)香酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵的添加比例、接種方式及作用機(jī)制等，并通過(guò)長(zhǎng)期跟蹤和多角度分析來(lái)確認(rèn)和優(yōu)化混菌發(fā)酵對(duì)果酒質(zhì)量的影響，以期更好地提升和改善果酒的風(fēng)味品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)水果資源的利用更大化。
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