2、結(jié)果與討論
2.1植酸酶AppA靶向基因修飾系統(tǒng)構(gòu)建
為了實(shí)現(xiàn)pGSA-appA基因在目標(biāo)細(xì)菌基因組中16S rRNA基因位點(diǎn)的靶向修飾，需要對(duì)原始pSPIN載體骨架進(jìn)行逐步改造。原始pSPIN的Spacer引導(dǎo)序列靶向定位于lacZ基因(圖2A)。第一步，將原始Spacer序列改造為針對(duì)目標(biāo)菌株的16s-spacer(該序列引導(dǎo)整個(gè)轉(zhuǎn)座復(fù)合體對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別)，見(jiàn)圖2B。第二步，以16s-pSPIN為基礎(chǔ)，對(duì)Cargo轉(zhuǎn)座子的啟動(dòng)子進(jìn)行改造。原始載體的Cargo基因缺少啟動(dòng)子，因此采用組成型啟動(dòng)子J23119，以實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，改造后得到質(zhì)粒J23119-16s-pSPIN(圖2C)。隨后，在J23119-16s-pSPIN質(zhì)?；A(chǔ)上對(duì)Cargo轉(zhuǎn)座子區(qū)域進(jìn)行改造，將pGSA-AppA融合蛋白基因酶切(圖3B)并連接在J23119啟動(dòng)子后10 bp左右處，構(gòu)建最終的植酸酶AppA表面展示系統(tǒng)載體，使其能夠在16S rRNA基因位點(diǎn)上表達(dá)(圖2D)。
▲圖2 pGSA-appA-pSPIN載體的構(gòu)建流程
▲圖3轉(zhuǎn)座插入(A)和pGSA-appA載體構(gòu)建(B)的PCR凝膠圖譜。M1：DL2000 DNA marker；泳道1：土著菌；泳道2：基因修飾菌；3：pGSA-appA酶切驗(yàn)證；4：pET-30a-pGSA的載體克隆驗(yàn)證；M2：DL5000 DNA marker。
錨定蛋白pGSA是枯草芽孢桿菌的γ-谷氨酸合成酶A(poly-γ-glutamic synthetase A)膜蛋白，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的表面展示。該錨定蛋白具有表面展示效率高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，且表面展示后的蛋白具有更高的活性和環(huán)境耐受性。AppA植酸酶最初發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌，由其基因組中的appA基因編碼，屬于組氨酸酸性磷酸酶(HAP)家族。植酸酶AppA的三維結(jié)構(gòu)包含一個(gè)催化域(負(fù)責(zé)水解植酸)和一個(gè)結(jié)構(gòu)輔助域(增強(qiáng)了底物結(jié)合能力)，是一種典型的6-植酸酶(6-phytase)，即優(yōu)先從植酸的D-6位點(diǎn)開(kāi)始水解磷酸酯鍵，依次生成IP5、IP4等低磷酸化肌醇衍生物，最終產(chǎn)物是無(wú)機(jī)磷酸和肌醇。
根據(jù)從黑土中分離的土著細(xì)菌皮氏羅爾斯頓氏菌(Ralstonia pickettii)G3的16S rRNA基因序列特征，設(shè)計(jì)pGSA-appA-pSPIN的Spacer序列，用于pGSA-appA的基因修飾，靶向位點(diǎn)位于27F后962 bp處。INTEGRATE系統(tǒng)通過(guò)Spacer序列的引導(dǎo)，會(huì)將整個(gè)R end-L end的Cargo區(qū)域轉(zhuǎn)座至目標(biāo)位點(diǎn)。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)座插入的成功，針對(duì)插入序列設(shè)計(jì)了特異性引物(27F/CM2R)，對(duì)嵌合16S rRNA基因的27F到R end之間的序列進(jìn)行PCR，其中CM2R是R end上的特征序列。凝膠電泳結(jié)果顯示，由于外源基因已成功插入基因組的目標(biāo)位置形成融合基因，因此可以通過(guò)特異性引物完成PCR過(guò)程；而原始菌株由于缺乏Cargo轉(zhuǎn)座區(qū)，因此無(wú)R end段序列，進(jìn)而無(wú)PCR產(chǎn)物(圖3A)。R.pickettii G3屬于革蘭氏陰性好氧菌，致病性較低，是環(huán)境中常見(jiàn)的一種細(xì)菌，能夠適應(yīng)復(fù)雜及惡劣環(huán)境，在許多環(huán)境污染修復(fù)方面表現(xiàn)出潛力，并且該菌可以通過(guò)共代謝的方式，與其他微生物互利共生，促進(jìn)生長(zhǎng)并提高環(huán)境修復(fù)效果。核糖體16S rRNA由細(xì)菌基因組上的基因序列轉(zhuǎn)錄而成，rrnDB數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，Ralstonia通常含有3-4個(gè)16S rRNA基因拷貝，因此其冗余的16S rRNA基因可以作為基因修飾的位點(diǎn)。
INTEGRATE系統(tǒng)的PAM序列為“CC”，緊隨其后的是引導(dǎo)的Spacer序列。對(duì)PCR測(cè)序結(jié)果顯示，pGSA-appA的Cargo區(qū)域插入到Spacer序列后49 bp處(圖4)。通常Cargo區(qū)域會(huì)插入到靶點(diǎn)Spacer序列后50 bp左右處，這與本研究的結(jié)果一致。Klompe等研究結(jié)果表明，當(dāng)轉(zhuǎn)座子序列的兩端(L end和R end)交換位置后其轉(zhuǎn)座效率更高。因此，本研究采用“R end”在前的載體構(gòu)建方法(圖1)。
▲圖4 pGSA-appA的插入位點(diǎn)
基因修飾是通過(guò)在宿主細(xì)胞內(nèi)插入一段目的基因或刪除某段特定基因，從而使原有宿主獲得新的功能或改變其基因型。理想的基因修飾技術(shù)應(yīng)不依賴DNA斷裂及同源重組，同時(shí)具備特異性和可編程性。基于CRISPR技術(shù)的最新進(jìn)展為微生物染色體的便捷整合提供了新的思路和方法。傳統(tǒng)的基因工程菌構(gòu)建通常使用模式菌株，或者具有特殊整合位點(diǎn)的菌株。最新研究表明，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以與細(xì)菌類Tn7轉(zhuǎn)座子結(jié)合，完成RNA引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座整合。隨著該技術(shù)的不斷改進(jìn)，INTEGRATE編輯系統(tǒng)得以開(kāi)發(fā)并初步應(yīng)用。該系統(tǒng)主要包括3個(gè)部分：目標(biāo)基因、TnsABC轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體以及Cas蛋白串，最終目標(biāo)基因在向?qū)NA的引導(dǎo)下，在目標(biāo)位點(diǎn)下游50 bp左右處完成整合。然而，將該技術(shù)應(yīng)用于黑土根際微生物菌群的功能基因修飾方面，目前仍處于空白狀態(tài)。目前，該系統(tǒng)的插入目標(biāo)位點(diǎn)主要為L(zhǎng)acZ以及一些經(jīng)過(guò)篩選的安全位點(diǎn)，缺乏更便利的候選插入位點(diǎn)。本研究使用16S rRNA基因作為修飾基因的靶點(diǎn)，并驗(yàn)證了該位點(diǎn)的可行性，從而實(shí)現(xiàn)了在任意菌株上快速的靶向轉(zhuǎn)座和基因修飾。值得注意的是，由于載體的轉(zhuǎn)化需要借助E.coli WM3064的結(jié)合轉(zhuǎn)移，因此該方法僅適用于革蘭氏陰性菌。此外，更為復(fù)雜的環(huán)境，例如土壤中的微生物菌群能否實(shí)現(xiàn)快速的基因整合，也是重要的研究方向。
2.2基因修飾菌的生長(zhǎng)和植酸酶活性檢測(cè)
在生長(zhǎng)曲線對(duì)比分析中發(fā)現(xiàn)，與未改造的原始菌相比，基因修飾菌在穩(wěn)定期的OD600吸光度略低，但二者較為接近(圖5A)。由于轉(zhuǎn)座的位置是核糖體的16S rRNA基因位點(diǎn)，核糖體主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成和加工，對(duì)其位置進(jìn)行改造可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)狀況的改變。然而，本研究結(jié)果表明，對(duì)冗余的16S rRNA基因進(jìn)行嵌入不會(huì)明顯抑制或影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。
▲圖5基因修飾菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)對(duì)比及對(duì)植酸的水解。A：生長(zhǎng)曲線對(duì)比；B：不同底物濃度的水解率；C：pH對(duì)植酸酶活性的影響。
隨后，檢測(cè)了植酸酶基因修飾菌在不同植酸濃度條件下的水解能力。結(jié)果顯示基因修飾菌表現(xiàn)出更高的水解能力(圖5B)，其水解植酸的能力是原始菌的8倍以上。由于原始菌擁有其他種類的磷酸酶，這些酶也會(huì)在一定程度上水解植酸，因此原始菌也表現(xiàn)出一定的植酸水解能力，但遠(yuǎn)低于基因修飾菌。此外，在低濃度植酸條件下，基因修飾菌(OD600值為1.0)可以在1 h內(nèi)水解超過(guò)80%的植酸，并且其水解率會(huì)隨著底物濃度升高而降低。
pH對(duì)基因修飾菌植酸酶活性的影響如圖5C所示。隨著pH值的增加，酶活性呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在pH 6.0時(shí)表現(xiàn)出最高的相對(duì)酶活性，隨后在堿性環(huán)境下酶活性會(huì)迅速下降，其相對(duì)酶活性在pH 8.0時(shí)僅為20%左右。植酸酶是一種酸性磷酸酶，因此堿性環(huán)境不利于植酸酶活性的維持，之前的研究結(jié)果也表明植酸酶在堿性環(huán)境中活性會(huì)迅速降低。
為了使植酸酶在基因修飾菌中穩(wěn)定表達(dá)，本研究使用了組成型的J23119啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可以不依賴誘導(dǎo)物而自行啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，并且其表達(dá)量適中，基本不會(huì)影響宿主的生長(zhǎng)。目前，只有少數(shù)植酸酶成功展示在細(xì)胞表面，且常用模式生物作為宿主，例如酵母和枯草芽孢桿菌，并且其表面展示通常借助表達(dá)載體。雖然表達(dá)載體使用較為便捷，但其使用會(huì)導(dǎo)致一些潛在問(wèn)題，例如持續(xù)的篩選壓力、抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移、載體丟失等，這使得其在使用過(guò)程中存在更高的風(fēng)險(xiǎn)。本研究將整個(gè)植酸酶表面展示的融合蛋白轉(zhuǎn)座至細(xì)菌基因組，可以保證其穩(wěn)定表達(dá)，且由于該系統(tǒng)是無(wú)痕編輯，因此不存在抗生素抗性基因泄漏的風(fēng)險(xiǎn)。
2.3土壤有機(jī)磷活化
在添加植酸酶基因修飾的R.pickettii G3菌后，處理組的土壤表現(xiàn)出更高的植酸酶活性，是對(duì)照土壤植酸酶活性的2倍以上。在第21天時(shí)，植酸酶活性緩慢下降，但其活性仍可長(zhǎng)期保持，在28 d后其植酸酶活性依然保留1.5倍左右(圖6A)。土壤植酸酶活性結(jié)果顯示，植酸酶基因修飾菌株極大地提高了對(duì)土壤植酸的水解潛力。
▲圖6土壤植酸酶活性和有效磷含量變化。A：土壤植酸酶活性對(duì)比；B：土壤速效磷含量對(duì)比。
植酸酶會(huì)水解土壤中的植酸并釋放磷酸根，從而提高土壤速效磷含量。對(duì)土壤速效磷的檢測(cè)結(jié)果顯示，從第7天開(kāi)始，土壤速效磷含量顯著提高，在第14天后達(dá)到最高水平，提高了近30%(圖6B)。由于大豆對(duì)土壤磷的攝取，土壤中磷含量會(huì)緩慢下降，但整體上基因修飾菌添加組的速效磷含量高于對(duì)照組。其他研究結(jié)果表明，提高土壤植酸酶活性可以顯著提高土壤速效磷水平，最高可提高54.48%的速效磷含量，并且這種促進(jìn)效果可以維持較長(zhǎng)時(shí)間。此外，其他研究也采用類似策略，通過(guò)添加外源植酸酶的方式，水解了土壤中近17.0%的植酸，并提高了22.5%的有效磷含量。目前，許多產(chǎn)植酸酶的根際菌被用于植物促生，接種促生菌后，根長(zhǎng)、磷含量、生物量和產(chǎn)量均有顯著改善。然而，野生菌的遺傳調(diào)控通常難以控制，實(shí)際應(yīng)用可能會(huì)超出預(yù)期。
轉(zhuǎn)基因微生物在環(huán)境修復(fù)和藥品生產(chǎn)等領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛力。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因微生物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)可以得到有效控制和評(píng)估。CRISPR基因組編輯是一種典型的“無(wú)標(biāo)記”基因編輯技術(shù)，可避免抗性基因的潛在危害。此外，荷蘭的研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了30多年的觀察，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌有明顯的環(huán)境影響，表明它們是可以安全使用的。
3、結(jié)論
目前，已報(bào)道的CRISPR引導(dǎo)轉(zhuǎn)座研究中均缺乏通用的基因轉(zhuǎn)座位點(diǎn)。許多細(xì)菌基因是單拷貝基因，并且由于環(huán)境中的細(xì)菌通常為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，許多細(xì)菌并不一定擁有已報(bào)道的轉(zhuǎn)座靶位點(diǎn)，例如LacZ基因，這無(wú)疑限制了INTEGRATE等CRISPR轉(zhuǎn)座技術(shù)的應(yīng)用。本研究基于CRISPR引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座插入技術(shù)，創(chuàng)造性地將目標(biāo)菌的16S rRNA基因位點(diǎn)作為靶點(diǎn)，進(jìn)行快速基因修飾。16S rRNA基因位點(diǎn)作為轉(zhuǎn)座靶點(diǎn)，一方面省去了復(fù)雜的安全位點(diǎn)篩選，同時(shí)由于其為多拷貝基因，因此在基因組中部分16S rRNA基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座并不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因菌的生長(zhǎng)造成影響。此外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，功能基因可以快速完成靶向轉(zhuǎn)座，其位置可以通過(guò)Spacer序列進(jìn)行精確定位。此外，細(xì)胞分裂基因也是微生物所共有的基因之一，同樣可以作為基因修飾的候選靶點(diǎn)。
完成外來(lái)基因在目標(biāo)細(xì)菌基因組上的整合后，其功能能否發(fā)揮是另一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。本研究使用組成型啟動(dòng)子J23119，可保證目的基因在土壤環(huán)境中的穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)植酸酶基因修飾的土著菌獲得了極高的植酸酶活性，并且其功能具有較寬的pH譜。將基因修飾菌施用于黑土后，土壤植酸酶活性提高了2倍左右，土壤速效磷含量也顯著提高。因此，通過(guò)CRISPR轉(zhuǎn)座介導(dǎo)的基因修飾可以賦予土著菌新的功能。植酸酶活性的提高可以有效活化土壤有機(jī)磷庫(kù)，釋放速效磷。通過(guò)基因修飾的微生物策略對(duì)于黑土等土壤的元素活化具有一定的潛力和研究?jī)r(jià)值。
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