摘要
目的
通過(guò)敲除生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2（ST2）表達(dá)探討其對(duì)ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎（AIH）小鼠腸道菌群的影響。
方法
借助基因敲除技術(shù)，構(gòu)建ST2基因敲除小鼠，在此基礎(chǔ)上采用ConA誘導(dǎo)建立AIH小鼠模型；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)量；使用16S rRNA高通量測(cè)序方法進(jìn)行腸道微生物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Microbial Ecology相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。
結(jié)果
與對(duì)照組相比，在敲除ST2基因后，ConA誘導(dǎo)的AIH小鼠血清中ALT和AST水平降低，肝臟損傷較輕且IL-6相對(duì)表達(dá)量也降低；反應(yīng)菌群分布豐度的ACE和CHAO指數(shù)無(wú)明顯差異；反映菌群多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)無(wú)明顯差異；Psychrobacter、unclassified_Clostridia、Halothiobacillus、Clostridium_XlVa和Haemophilus菌屬含量增加；Romboutsia、Rikenella、Parabacteroides和unclassified_Clostridiales菌屬含量減低，其受試者工作特征（ROC）曲線下面積分別為0.88、0.89、0.88、0.80、0.90、0.90、0.84、0.91和0.84。
結(jié)論
在AIH小鼠體內(nèi)敲除ST2基因表達(dá)可減輕肝損傷及炎癥，不影響腸道菌群的分布豐度及多樣性，但菌屬間具有差異性，且具有良好的診斷價(jià)值。
自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種以血清自身抗體陽(yáng)性、高免疫球蛋白G和或γ球蛋白血癥、肝組織學(xué)上存在界面性肝炎的肝臟實(shí)質(zhì)性炎癥。多項(xiàng)研究提示腸道微生態(tài)在AIH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其機(jī)制有分子模擬、腸屏障破壞、淋巴細(xì)胞歸巢等。最新研究表明AIH患者糞便菌群結(jié)構(gòu)與功能的改變，提示腸道菌群作為非侵入性生物標(biāo)志物用于評(píng)估疾病活動(dòng)度的潛在可能性；另有研究人員發(fā)現(xiàn)益生菌通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群和腸道通透性來(lái)抑制促炎因子的釋放從而緩解小鼠AIH，這些研究均表明腸道菌群是AIH發(fā)生發(fā)展的重要因素。IL-33是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)屬于IL-1家族中的一種新型炎癥因子，在過(guò)敏反應(yīng)、寄生蟲感染、癌癥、組織纖維化、慢性炎癥、器官移植和風(fēng)濕性免疫疾病中的發(fā)揮重要作用。IL-33受體復(fù)合物是由IL-1受體附屬蛋白（IL-1RACP）和IL-1受體1型（IL1R1）編碼的ST2組成的異二聚體復(fù)合物。有研究表明IL-33/ST2可能在AIH的發(fā)病機(jī)制和嚴(yán)重程度中發(fā)揮重要作用，是治療AIH的重要靶點(diǎn)，但其具體作用機(jī)制仍有待研究。IL-33/ST2在AIH中的作用是否與腸道菌群有關(guān)呢？本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)蛋白CCN1可通過(guò)上調(diào)IL-6的產(chǎn)生促進(jìn)AIH的炎癥反應(yīng)。本研究將進(jìn)一步探討影響AIH發(fā)病的可能因素，首先擬通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建ST2敲除小鼠，經(jīng)刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導(dǎo)小鼠成為AIH小鼠后，采用RT-PCR、16S rRNA高通量測(cè)序和微生物多樣性分析等方法探討敲除ST2表達(dá)對(duì)AIH小鼠腸道菌群的影響，以期為闡明IL-33/ST2在AIH發(fā)病中的作用，完善AIH的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
50只C57BL/6J小鼠（體質(zhì)量18~20 g，5周齡）購(gòu)自上海斯萊克公司；ST2敲除小鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)；小鼠實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審定，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。
1.1.2 主要試劑與儀器
ConA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；SYBR GreenPremix Ex Taq PCR試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司；cobas 702全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自德國(guó)羅氏公司，PCR引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。
表1 基因引物序列
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