1.4定向馴化
從YPD平板挑取生長(zhǎng)較好的初代單菌落于YPD活化培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL的菌液4℃、5 000×g離心5 min收集細(xì)胞，用無(wú)菌水重懸，最終以初始OD600=0.2接種于抑制物濃度為0.2 g/L的馴化培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)24?48 h，使得酵母細(xì)胞OD600值達(dá)到2.0?3.0左右(即進(jìn)入穩(wěn)定期)，重復(fù)上述步驟2?3次，直至酵母細(xì)胞在當(dāng)前濃度的抑制物脅迫下生長(zhǎng)速度顯著提高；接著，以相同的初始OD600值再次接種至抑制物濃度為0.4 g/L的馴化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期，在此濃度下重復(fù)培養(yǎng)2?3次，以此類(lèi)推，直至完成所有濃度批次的馴化。馴化結(jié)束后取菌液劃線YPD平板培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落作為最終的進(jìn)化菌株,接種至YPD活化培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12?16 h備用，并甘油保存于?80℃。不同抑制物的濃度都是以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L梯度提高。
1.5進(jìn)化菌株抑制脅迫下的生長(zhǎng)
取進(jìn)化菌株的活化液劃線平板培養(yǎng)，挑取單菌落于適量無(wú)菌ddH2O中，使各個(gè)菌液的OD600保持一致，并將重懸的細(xì)胞稀釋4個(gè)梯度(1、10、100、1 000倍)，分別吸取4μL對(duì)應(yīng)的菌液點(diǎn)樣于添加了不同濃度抑制物的檢測(cè)平板上，30℃倒置培養(yǎng)2?3 d，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照保存。
1.6進(jìn)化菌株的發(fā)酵性能監(jiān)測(cè)
取進(jìn)化菌株活化液，接種在含有50 mL的150 mL錐形瓶中，30℃、200 r/min培養(yǎng)12?16 h作為發(fā)酵種子液。取2.5 mL種子液以相同的OD600值接種至含有不同濃度抑制物的YPD發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)3?4 d，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)定葡萄糖、糠醛、對(duì)羥基苯甲酸、乙醇等物質(zhì)的含量。
1.7樣品分析
菌株生長(zhǎng)量用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，取不同時(shí)間段的發(fā)酵液于600 nm吸收波長(zhǎng)下讀取OD值。發(fā)酵液中的各物質(zhì)含量測(cè)定用高效液相色譜法，其中葡萄糖和乙醇含量的檢測(cè)用醇柱，柱溫50℃，流速0.5 mL/min，流動(dòng)相為5 mmol/L的硫酸溶液。
1.8基因組重測(cè)序
分別挑取出發(fā)菌株W303-1A和不同抑制物下馴化完成的單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)24?48 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定期后，收集菌液，液氮快速冷卻后，置?80℃存放待測(cè)。
重測(cè)序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司利用Illumina測(cè)序平臺(tái)完成。Illumina MiSeqTM得出的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(sequenced reads)。此外，對(duì)原始數(shù)據(jù)質(zhì)量值等信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并使用FastQC對(duì)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行可視化評(píng)估。
2結(jié)果與討論
2.1 W303-1A的定向馴化
以適合實(shí)驗(yàn)室研究的營(yíng)養(yǎng)缺陷型單倍體菌株W303-1A作為出發(fā)菌株，分別以糠醛、對(duì)羥基苯甲酸以及糠醛+對(duì)羥基苯甲酸作為脅迫條件對(duì)其進(jìn)行定向馴化，主要過(guò)程如圖1所示。經(jīng)過(guò)50 d的培養(yǎng)后涂布于含有2.0 g/L抑制物的YPD平板，將平板倒置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24?48 h分離單克隆。篩選得到糠醛抗性提高的5株菌，分別命名為F-1、F-2、F-3、F-4、F-5，對(duì)羥基苯甲酸抗性提高的菌株5株，分別命名為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，以及糠醛+對(duì)羥基苯甲酸抗性提高的菌株5株，分別命名為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5。
圖1酵母抗抑制物馴化過(guò)程示意圖
2.2抑制物脅迫下原始菌株和馴化菌株的平板生長(zhǎng)情況
為了測(cè)試釀酒酵母W303-1A中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間馴化后是否能促進(jìn)糠醛和對(duì)羥基苯甲酸脅迫下的生長(zhǎng)性能，比較了經(jīng)糠醛馴化后生長(zhǎng)較好的5株菌(即F-1、F-2、F-3、F-4、F-5)和對(duì)照菌株(W303-1A)在含有不同糠醛濃度培養(yǎng)基中的有氧生長(zhǎng)活性(圖2A)。馴化后5株菌在糠醛為0.8 g/L的YPD板上能夠較好地生長(zhǎng)，而原始菌株在0.8 g/L糠醛的YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)相對(duì)較弱。原始菌株在1.2 g/L糠醛的YPD培養(yǎng)基上也能夠存活，但生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)慢于馴化后的菌株。馴化后的5株菌在含有1.6 g/L糠醛的YPD的培養(yǎng)基中也可以較好地生長(zhǎng)，而未經(jīng)馴化的原始菌株則無(wú)法生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基中糠醛的濃度提升至2.0 g/L時(shí)，馴化的菌株中F-2的生長(zhǎng)速度明顯高于其他4株馴化菌株，以上結(jié)果表明，馴化后的菌株對(duì)糠醛產(chǎn)生了一定的耐受性，其中，F(xiàn)-2菌株的耐受性最好。
圖2不同濃度的糠醛(A)、對(duì)羥基苯甲酸(B)和糠醛+對(duì)羥基苯甲酸(C)抑制脅迫下原始菌株和馴化菌株的平板生長(zhǎng)情況
此外，本研究測(cè)試了經(jīng)對(duì)羥基苯甲酸梯度馴化后的菌株耐受性。如圖2B所示，挑取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的5株馴化后菌株在含有0.8、1.2、1.6、2.0 g/L對(duì)羥基苯甲酸濃度的YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并評(píng)估菌落的生長(zhǎng)情況。與原始菌株W303-1A相比，馴化后酵母菌株并無(wú)明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。此外，隨著對(duì)羥基苯甲酸濃度的增加，馴化后的5株酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況與原始菌株W303-1A相似且均可以很好地生長(zhǎng)。其中，馴化后的菌株在2.0 g/L對(duì)羥基苯甲酸條件下的生長(zhǎng)優(yōu)于對(duì)照菌株，這些結(jié)果表明，定向馴化能夠一定程度上提升菌株在對(duì)羥基苯甲酸脅迫條件下的生長(zhǎng)性能。
為了評(píng)估糠醛和對(duì)羥基苯甲酸的協(xié)同抑制對(duì)馴化菌株的毒性，測(cè)定了不同濃度糠醛和對(duì)羥基苯甲酸(0.8、1.2、1.6、2.0 g/L)的YPD平板上菌株的生長(zhǎng)速度。圖2C顯示了原始菌株以及馴化后菌株的生長(zhǎng)情況，對(duì)于馴化后的菌株，在0.8 g/L和1.2 g/L的抑制物濃度下未觀察到生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。隨著抑制物濃度的增加，5株經(jīng)馴化后的菌株細(xì)胞生長(zhǎng)均受到明顯的生長(zhǎng)抑制，在1.6 g/L的濃度時(shí)，原始菌株已無(wú)法正常適應(yīng)當(dāng)前的環(huán)境，此外，馴化的菌株生長(zhǎng)也受到了一定的抑制。尤其是在濃度2.0 g/L時(shí)，幾乎所有的菌株均不能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在添加0.8–1.6 g/L糠醛和對(duì)羥基苯甲酸的條件下，B-2的生長(zhǎng)速度始終高于其他4株馴化菌株，以上結(jié)果表明，馴化后的菌株對(duì)抑制物協(xié)同作用的環(huán)境產(chǎn)生了一定的耐受性，其中，B-2菌株的耐受性最好。
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