摘要
目的
分析胸膜肺炎放線桿菌（APP）臨床分離株的優(yōu)勢(shì)血清型，獲得疫苗候選菌株。
方法
從國內(nèi)疑似分離株中鑒定獲得53株APP菌株，鑒定各菌株血清型及評(píng)價(jià)其生物學(xué)特性后，利用大蠟螟和小鼠模型篩選評(píng)估有價(jià)值的疫苗候選菌株。
結(jié)果
53株APP中血清型占比由高到低依次為1、7、15、5型，各菌株在體外生長存活能力強(qiáng)，具有不同程度的溶血活性。MIC結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)氟苯尼考敏感度較低，而對(duì)頭孢類藥物高度敏感。用大蠟螟和小鼠模型從每個(gè)血清型菌株中各篩選到一株高毒力候選菌株。其中，1型菌株制備的滅活疫苗能夠以小于商品化疫苗中1型菌株1/5的劑量，保護(hù)100%同血清型攻毒小鼠存活。同時(shí)，商品化疫苗中缺乏的15型菌株制備的滅活疫苗對(duì)同血清型攻毒小鼠保護(hù)率為66.7%，高于商品化疫苗的保護(hù)率。
結(jié)論
本研究篩選獲得高毒力的優(yōu)勢(shì)血清型1、5、7、15型菌株各一株，根據(jù)免疫劑量和免疫保護(hù)率分析，其中的1型菌株和15型菌株有開發(fā)為新疫苗候選菌株的潛力。
胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是豬的重要呼吸系統(tǒng)病原菌，能引起豬傳染性胸膜肺炎，該病具有傳染性強(qiáng)、致死率高的特點(diǎn)，急性病例以纖維性、出血性胸膜肺炎為特征，在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成廣泛危害?？股厥欠乐蜛PP的有效手段，隨著我國減抗、限抗政策的推進(jìn)，APP耐藥性問題也日益受到關(guān)注，為了減少抗生素的使用量，控制細(xì)菌耐藥性的發(fā)生率，疫苗的使用顯得更加重要。
根據(jù)細(xì)菌脂多糖與莢膜多糖等抗原不同，可將APP分為19個(gè)血清型。不同國家和地區(qū)的APP流行學(xué)血清型各不完全相同。在歐洲，血清型2、3、6、9較為流行，而墨西哥則以血清型1、3、5b、7流行最廣泛，澳大利亞和韓國流行的優(yōu)勢(shì)血清型有1型和5型。2001年，逯忠新等經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查7個(gè)不同省份流行血清型主要有1、3和7型；馬爽等從23個(gè)省份1990—2014年的病料中分離鑒定到62株APP，其中2、5、7型菌株數(shù)量占總數(shù)的77.5%，但根據(jù)毒力強(qiáng)弱結(jié)果的分析，引起危害較大的主要為1、5、7型。隨著時(shí)間變化，近幾年國內(nèi)5型、8型及15型等血清型也表現(xiàn)出流行趨勢(shì)，而3型菌株檢出率有所降低，盧碧凱等對(duì)臨床分離株鑒定發(fā)現(xiàn)8型為近幾年浙江地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型，其次為5、7、15型。滅活疫苗具有安全穩(wěn)定、無返毒風(fēng)險(xiǎn)、易生產(chǎn)和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，不同國家和地區(qū)需要根據(jù)本地流行血清型研制相應(yīng)的多價(jià)滅活疫苗。目前國內(nèi)使用的商品化滅活疫苗抗原主要是血清型1、2、7型菌株，近幾年也有研究者在山東地區(qū)分離到APP血清1、5、7型，以此制備三價(jià)滅活疫苗并評(píng)價(jià)其在豬身上的免疫保護(hù)效果。由于APP不同血清型之間交叉保護(hù)能力低，而血清流行情況又不斷發(fā)生變化，已有的商品化疫苗可能對(duì)新流行的血清型菌株保護(hù)效果有限。因此，有必要在了解國內(nèi)APP最新流行的優(yōu)勢(shì)血清型的基礎(chǔ)上篩選新的疫苗候選菌株。
本研究擬對(duì)國內(nèi)2021—2022年的APP臨床分離菌株進(jìn)行血清型分型鑒定，檢測其生物學(xué)特性，并對(duì)其耐藥性進(jìn)行分析；同時(shí)篩選體外生長狀況良好、毒力強(qiáng)的菌株作為疫苗候選菌株，在小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)力，以期為傳統(tǒng)疫苗的更新提供候選毒株。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
試驗(yàn)所用的APP臨床菌株為2021—2022年疑似患有豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)病豬的病料中獲得，由武漢科前生物股份有限公司診斷實(shí)驗(yàn)室分離并保存，臨床分離菌株來源于廣東、甘肅、四川等10個(gè)省份，其中，26株來自江西；7株來自云南；6株來自甘肅；4株來自陜西；3株來自海南；2株來自四川；2株來自福建；山西、廣東、江蘇各分離到1株。大蠟螟幼蟲購自武漢維物起源生物科技有限公司；6周齡Balb/c雌鼠和4周齡KM雌鼠購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.1.2主要試劑
胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）購自美國BD公司；水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MH）購自O(shè)XOID北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；2×Taq Mixture及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker購自Takara公司；羊抗鼠HRP酶標(biāo)二抗購自武漢三鷹技術(shù)有限公司；QIAGEN Multiplex PCR Kit購自德國QIAGEN公司；所有抗生素均購自biosharp蘭杰柯公司；豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗購自武漢科前生物股份有限公司。
1.2方法
1.2.1臨床菌株的鑒定及血清型分型
使用APP特異性基因apxIV片段引物進(jìn)行鑒定，大小為422 bp，陽性對(duì)照為實(shí)驗(yàn)室保存的血清1型菌株4 074。進(jìn)一步采用針對(duì)APP 1-15血清型特異性基因的引物進(jìn)行擴(kuò)增鑒定各菌株血清（表1）。PCR的反應(yīng)體系為：模板1μL，2×Multiplex PCR Master Mix 10μL，上游引物各1μL，下游引物各1μL，ddH2O補(bǔ)齊至20μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s；60℃退火90 s；72℃延伸150 s；30個(gè)循環(huán)后；68℃再延伸10 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。其中APP血清型1型、5型、7型和15型特異性基因分別為cps1B（959 bp）、cps5B（825 bp）、cps7E（601 bp）、cpscps15B和cps15C（1 595 bp）。
表1試驗(yàn)所用引物
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