1材料和方法


1.1材料與裝置


宿主藻：席藻(Phormidium sp.)為本課題組2009年在武漢分離得到[20]。噬藻體：噬藻體PP為本課題組2001年在武漢分離得到[26]。


自制SECT培養(yǎng)箱：培養(yǎng)箱的溫控系統(tǒng)由溫度控制器、風(fēng)扇、加熱器等組成，實(shí)測(cè)箱內(nèi)溫度波動(dòng)范圍為±0.2℃。CO2濃度控制系統(tǒng)由CO2鋼瓶、緩沖箱、CO2控制器、電磁閥、氣泵、減壓閥等構(gòu)成，其中CO2鋼瓶中的高濃度CO2先經(jīng)減壓閥和電磁閥輸入至緩沖箱(一級(jí)CO2控制器通過(guò)控制電磁閥啟閉使緩沖箱內(nèi)的pCO2濃度為(2000±200)ppm)，緩沖箱內(nèi)的氣體再經(jīng)微型氣泵輸入至SECT培養(yǎng)箱(二級(jí)CO2控制器通過(guò)控制微型氣泵的啟閉使SECT培養(yǎng)箱內(nèi)的pCO2濃度的波動(dòng)幅度達(dá)到±50 ppm)。


1.2宿主藻的培養(yǎng)


用AA液體培養(yǎng)基[35]培養(yǎng)席藻，光暗比為14 h∶10 h，光強(qiáng)為2000 lx。為更好地模擬全球氣候變化過(guò)程中大氣二氧化碳濃度升高的實(shí)際過(guò)程，采用頂空法控制pCO2濃度(而非直接將CO2通入培養(yǎng)液中)。SECT分組為：CK組，25℃+400 ppm；RCP4.5，27.4℃+538 ppm；RCP6.0，28.0℃+670 ppm；RCP8.5，29.8℃+936 ppm。其中，RCP4.5和RCP6.0代表中等強(qiáng)度的溫室效應(yīng)氣體排放，而RCP8.5代表高強(qiáng)度的溫室效應(yīng)氣體排放[1]。


為使席藻充分適應(yīng)上述溫度和二氧化碳條件，先使該藻在上述條件下傳代培養(yǎng)10個(gè)月后，再將其藻細(xì)胞密度稀釋至2.0×106 cells/mL，繼續(xù)在相應(yīng)SECT條件下培養(yǎng)，每天采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法測(cè)定藻細(xì)胞密度，并取對(duì)數(shù)期藻用于后續(xù)試驗(yàn)。


1.3噬藻體PP對(duì)宿主藻的吸附率的測(cè)定


由于隨著RCP等級(jí)的逐步提高(主要是由于二氧化碳濃度的逐步升高)，對(duì)數(shù)期藻液的pH比對(duì)照組分別下降了0.05，0.10和0.25，為了使稀釋后的藻液仍保留此pH差異，取對(duì)數(shù)期藻液用0.02μm濾膜過(guò)濾收集濾液，再用濾液稀釋相應(yīng)的對(duì)數(shù)期藻液，使其初始藻細(xì)胞密度達(dá)到1.0×107 cells/mL。將效價(jià)(即具有增殖能力的病毒的濃度[36])為1.0×108 PFU/mL的噬藻體PP，按照MOI(multiplication of infectivity，即噬藻體效價(jià)與宿主細(xì)胞濃度的比例[36])為1∶104的比例加入稀釋后的藻液中，充分混勻后置于相應(yīng)SECT條件下培養(yǎng)，分別在0、15、30、45和60 min時(shí)取1 mL于12000×g離心5 min，采用96孔板法(8平行4梯度)測(cè)上清中的效價(jià)[36]。將0 min的效價(jià)記為P0，其它時(shí)間點(diǎn)的效價(jià)記為Pi，吸附率=(P0-Pi)/P0×100%[36]。


1.4裂解曲線和一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定


用1.3中的方法將對(duì)數(shù)期藻液的細(xì)胞密度稀釋至1.0×107 cells/mL。加入初始效價(jià)為1.0×108 PFU/mL的噬藻體PP，使MOI為1∶1，混勻后放在對(duì)應(yīng)SECT條件下靜置吸附30 min。再將混合液于18000×g離心10 min，用相應(yīng)的濾過(guò)液對(duì)沉淀洗滌3次(以徹底去除未吸附的噬藻體PP)。再將樣品分為a、b兩組，a組用于顯微鏡檢計(jì)藻細(xì)胞數(shù)，b組則用上述濾過(guò)液梯度稀釋100倍和10000倍。將a、b樣品放在對(duì)應(yīng)SECT條件的搖床上100轉(zhuǎn)/min振蕩培養(yǎng)(用于防止已釋放的子代噬藻體PP吸附到臨近的藻絲上)，并分別在0、60、90、120、150、180、210、240、270和300 min時(shí)從a組中取樣鏡檢測(cè)量藻細(xì)胞數(shù)并據(jù)此繪制藻細(xì)胞的裂解曲線，同時(shí)從b組中取樣用96孔板法測(cè)量噬藻體PP的效價(jià)，各時(shí)間點(diǎn)的噬藻體釋放量=Pi/Ai(其中Ai為被裂解的藻細(xì)胞數(shù)=初始藻細(xì)胞數(shù)-該時(shí)刻的剩余藻細(xì)胞數(shù)，Pi為噬藻體效價(jià)的增加量=該時(shí)刻的噬藻體效價(jià)-初始噬藻體效價(jià)[36])，并據(jù)此繪制噬藻體PP的一步生長(zhǎng)曲線。


1.5紫外損傷噬藻體的光修復(fù)率的測(cè)定


將噬藻體PP裂解液(其效價(jià)計(jì)為“原始效價(jià)”)置于12μW/cm2的UV-B燈下照射30 min進(jìn)行紫外損傷處理后，取0.1 mL紫外損傷的噬藻體PP分別在白光和紅光條件下采用空斑法測(cè)定其效價(jià)。由于紫外損傷的噬藻體能夠在白光(主要是波長(zhǎng)為300~500 nm的光)條件下被宿主光修復(fù)，而在波長(zhǎng)大于620 nm的紅光條件下則不會(huì)發(fā)生光修復(fù)，故紫外損傷噬藻體的光修復(fù)率可通過(guò)以下公式計(jì)算得到[19]：


光修復(fù)率%=白光條件下的效價(jià)一紅光條件下的效價(jià)原始效價(jià)-紅光條件下的效價(jià)


(1)


1.6藻細(xì)胞密度的測(cè)定


先將隨機(jī)測(cè)量的20條藻絲總長(zhǎng)度除以這20條藻絲的總細(xì)胞數(shù)，即得到每個(gè)藻細(xì)胞的平均長(zhǎng)度，再將20~50個(gè)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室(每個(gè)計(jì)數(shù)室的體積為0.1 mm3)內(nèi)的藻絲總長(zhǎng)度除以每個(gè)藻細(xì)胞的平均長(zhǎng)度即得到這20~50個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)的藻細(xì)胞數(shù)，并據(jù)此計(jì)算藻細(xì)胞密度。


1.7統(tǒng)計(jì)分析


上述試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行，作圖采用Graphpad Prism 5完成(圖表中的誤差量均用±SD表示)；數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0完成，其中吸附率曲線采用單變量一般線性模型分析，宿主藻生物量、噬藻體平均釋放量和紫外損傷修復(fù)率采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著性差異法(least significant difference，LSD)法。


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