2.2 hrcN基因打靶序列片段的構(gòu)建
突變體篩選的抗性基因采用Gm抗性基因（長(zhǎng)度832 bp），hrcN基因上游同源重組臂和下游同源重組臂長(zhǎng)度分別為799和742 bp，利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建打靶序列片段（上游同源重組臂-Gm抗性基因編碼序列-下游同源重組臂），長(zhǎng)度為2373 bp。圖3電泳圖顯示，泳道1中有4條帶，其中最亮的條帶為打靶序列片段，電泳結(jié)果表明成功構(gòu)建了打靶序列片段。
2.3 hrcN基因突變株的構(gòu)建
將供菌體和受菌體（CBM613菌株）混合結(jié)合后，抗性平板上培養(yǎng)單克隆，隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆，用hrcN基因內(nèi)部引物進(jìn)行PCR鑒定。如發(fā)生二次重組，則這對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，否則有227 bp的特異性擴(kuò)增條帶。圖4結(jié)果顯示：第1～6號(hào)克隆為陰性擴(kuò)增，表明hrcN基因可能已被敲除；7～10號(hào)克隆有227 bp的特異性條帶，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生二次重組，hrcN基因未能成功敲除。
將上述1號(hào)克隆再次進(jìn)行hrcN基因內(nèi)部引物鑒定，為陰性擴(kuò)增后用hrcN基因外側(cè)引物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。圖5顯示，條帶2為原始菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2739 bp；條帶1為Gm抗性基因替換菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2580 bp，同時(shí)測(cè)序結(jié)果顯示局部序列同設(shè)計(jì)。該克隆子為最終的hrcN基因被Gm抗性基因替換的陽(yáng)性克隆，稱為：CBM613/ΔhrcN。
2.4回補(bǔ)菌株的篩選及鑒定
在Tc平板上的陽(yáng)性克隆用pRK415-F/pRK415-R載體引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。當(dāng)hrcN克隆入設(shè)計(jì)位點(diǎn)后，這對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1634 bp。圖6結(jié)果顯示，1～6號(hào)全部克隆都有預(yù)期長(zhǎng)度的特異片段擴(kuò)增，取第1號(hào)克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示與設(shè)計(jì)一致。經(jīng)轉(zhuǎn)化CBM613/ΔhrcN受體菌后，涂布篩選出陽(yáng)性克隆，pRK415-F/pRK415-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有預(yù)期長(zhǎng)度的特異片段擴(kuò)增，表明青枯雷爾氏菌突變株hrcN基因回補(bǔ)成功。
2.5 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇虏×Φ挠绊?
hrcN基因敲除后，在NA培養(yǎng)基上28℃生長(zhǎng)5 d，突變株和回補(bǔ)菌株菌落形態(tài)與野生型菌株相比無(wú)明顯變化（圖7）。進(jìn)一步將野生型菌株、hrcN基因突變株和回補(bǔ)菌株采用根部接種法接種番茄測(cè)定致病力結(jié)果表明，野生型菌株接種番茄植株后，在第4 d開(kāi)始發(fā)病，突變株在第5 d才開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫癥狀。圖8為野生型菌株、突變株和回補(bǔ)菌株在接種后第7 d的發(fā)病情況可知，野生型菌株的病情指數(shù)為1.87，突變株僅為0.27，下降了85.56%；相比野生型菌株，回補(bǔ)菌株病情指數(shù)為1.67，突變株的致病力能夠部分恢復(fù)。接種12 d后，野生型菌株的病情指數(shù)高達(dá)3.49，而突變株僅為1.89，回補(bǔ)菌株有所恢復(fù)為3.18。接種試驗(yàn)結(jié)果顯示：突變株較野生型菌株的致病力下降，病程延長(zhǎng)，但并未喪失致病力，表明hrcN基因是青枯雷爾氏菌致病性相關(guān)的重要基因。
2.6 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇?a href="http://www.tlbhxj.com/" target="_blank">生長(zhǎng)曲線的影響
分別將CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補(bǔ)菌株在Boucher基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基（貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基）和CPG培養(yǎng)基（富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基）中進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定，野生型菌株、突變株和回補(bǔ)菌株在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率差異不明顯（圖9）。
3種青枯雷爾氏菌在貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，突變株比野生型菌株生長(zhǎng)更快（圖10），生長(zhǎng)速率開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），回補(bǔ)菌株與野生型菌株生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異。
2.7 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇\(yùn)動(dòng)性的影響
利用半固體SMM培養(yǎng)基，研究CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補(bǔ)菌株的運(yùn)動(dòng)性。通過(guò)測(cè)量菌落直徑，野生型菌株、突變株和回補(bǔ)菌株的運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有顯著差異，結(jié)果表明hrcN基因敲除沒(méi)有影響青枯雷爾氏菌的運(yùn)動(dòng)性（圖11）。
2.8 hrcN基因?qū)η嗫堇谞柺暇锉荒ば纬赡芰Φ挠绊?
通過(guò)對(duì)比菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突變株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回補(bǔ)菌株的生物被膜形成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種青枯雷爾氏菌株的生物被膜形成能力隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增強(qiáng)，突變株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力顯著減弱，而回補(bǔ)菌株與野生型菌株相比差異不明顯（圖12）。
相關(guān)新聞推薦
1、高密度發(fā)酵的過(guò)程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長(zhǎng)及外源基因的表達(dá)——結(jié)果
2、基于β-半乳糖苷酶Lac Z的UPR響應(yīng)指示菌株的構(gòu)建及生長(zhǎng)曲線測(cè)定——摘要
3、桑椹菌核病拮抗菌的分離篩選、鑒定、生防作用與機(jī)理——結(jié)果與分析