2結(jié)果與分析
2.1桑椹菌核病拮抗菌的分離篩選
從‘川桑7637’枝條中分離純化獲得98株內(nèi)生細(xì)菌，初篩結(jié)果顯示有18株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)S.sclerotiorum PZ-2有拮抗效果，復(fù)篩發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌C1R32、C3T5、C3N15、C3N16、C1R38、C3R1-2對(duì)病原菌PZ-2有較好的抑制效果(圖1A)，其中C1R32抑菌效果穩(wěn)定且最佳，抑菌率達(dá)66.47%(圖1A、1B)，因此選擇C1R32進(jìn)行后續(xù)研究。
圖1 Sclerotinia sclerotiorum PZ-2拮抗菌的復(fù)篩結(jié)果
2.2桑椹菌核病拮抗菌的鑒定
2.2.1形態(tài)學(xué)和生理生化特征
C1R32菌株在PDA和LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h后，其生長(zhǎng)形態(tài)無(wú)明顯差別，均展現(xiàn)出快速生長(zhǎng)特性，單菌落隆起，呈飽滿(mǎn)的圓形，乳白色，邊緣光滑，表面有光澤(圖2A、2B)；革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果顯示C1R32菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌(圖2C)，產(chǎn)橢圓形芽孢(圖2D)；生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果顯示C1R32能利用葡萄糖，水解淀粉、明膠，還原硝酸鹽，有接觸酶，Voges-Proskauer試驗(yàn)呈陽(yáng)性(表2)，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步將其鑒定為芽孢桿菌(Bacillus sp.)。
圖2 C1R32菌株形態(tài)特征
表2.C1R32菌株生理生化特征
2.2.2基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析
擴(kuò)增Bacillus sp.C1R32的16S rRNA基因序列，測(cè)序獲得長(zhǎng)為1 397 bp的片段，其在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，該片段與Bacillus subtilis菌株(登錄號(hào)為OQ586633.1)的16S rRNA基因序列相似度達(dá)到了100%?；?6S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，Bacillus sp.C1R32與B.subtilis NBRC 13719(NR112629.1)和B.subtilis JCM 1465(NR113265.1)聚在同一最小分支(圖3)，因此將C1R32鑒定為枯草芽孢桿菌，將其命名為B.subtilis C1R32。
圖3 Bacillus sp.C1R32菌株基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
2.3拮抗菌抑菌譜測(cè)定
抑菌譜檢測(cè)結(jié)果顯示，B.subtilis C1R32對(duì)多種植物病原菌具有抑制作用，其對(duì)Botryotinia fuckeliana抑菌率高達(dá)78.11%，對(duì)Colletrichum lagenarium、Botrytis cinerea、Cochiobolus sativus抑制率超過(guò)60.00%，對(duì)Colletotrichum gloeosporioides抑制率也超過(guò)50.00%，表明B.subtilis C1R32具有一定的廣譜抑菌能力(表3)。
表3.Bacillus subtilis C1R32抑菌譜檢測(cè)結(jié)果
2.4拮抗菌對(duì)桑椹菌核病的離體防效實(shí)驗(yàn)
B.subtilis C1R32對(duì)桑椹菌核病的離體防效檢測(cè)結(jié)果表明，接種病原菌后第2天，純水和LB液體培養(yǎng)基對(duì)照處理的桑椹均發(fā)病嚴(yán)重。B.subtilis C1R32菌懸液處理組桑椹病情指數(shù)為6.40，以純水處理組(病情指數(shù)為13.60)為對(duì)照計(jì)算其防效為52.94%。B.subtilis C1R32發(fā)酵上清液處理組病情指數(shù)為12.00，以LB液體培養(yǎng)基處理組(病情指數(shù)為22.40)為對(duì)照計(jì)算其防效為46.43%。整體而言，B.subtilis C1R32對(duì)桑椹菌核病具有良好離體防效，并且菌懸液防效優(yōu)于發(fā)酵上清液防效(表4)。
表4.Bacillus subtilis C1R32對(duì)桑椹菌核病的離體防效
2.5拮抗菌抑菌機(jī)理初探
2.5.1拮抗菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用
病原菌在不同含量B.subtilis C1R32發(fā)酵上清液的PDA平板上均明顯受到抑制，S.sclerotiorum PZ-2在含50%發(fā)酵上清液PDA平板上生長(zhǎng)完全被抑制，雖然隨著PDA平板中B.subtilis C1R32發(fā)酵上清液含量減少抑菌率逐漸下降，但含2%發(fā)酵上清液的PDA平板仍對(duì)S.sclerotiorum PZ-2有36.77%的抑制率(表5)。
表5.不同濃度Bacillus subtilis C1R32無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌的抑制活性
光學(xué)顯微鏡觀察B.subtilis C1R32發(fā)酵上清液對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果顯示，未用發(fā)酵上清液處理的病原菌菌絲粗壯，邊緣整齊，尖端圓潤(rùn)，菌絲內(nèi)容物均勻，菌絲呈現(xiàn)旺盛的生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖4A)。接種在含20%發(fā)酵上清液PDA平板上的S.sclerotiorum PZ-2菌絲變小，菌絲尖端膨大，內(nèi)容物大量流出，菌絲生長(zhǎng)滯緩(圖4B)；接種在含10%發(fā)酵上清液PDA平板上的S.sclerotiorum PZ-2菌絲斷裂，尖端不生長(zhǎng)，出現(xiàn)菌絲膨大現(xiàn)象(圖4C，黃色箭頭所指)；接種在含5%發(fā)酵上清液PDA平板上的S.sclerotiorum PZ-2菌絲與對(duì)照組相比顯著縮小，并呈現(xiàn)異常的彎折(圖4D，藍(lán)色箭頭所指)；接種在含3%和2%發(fā)酵上清液PDA平板上的S.sclerotiorum PZ-2菌絲細(xì)小，顯示出異常的彎折生長(zhǎng)(圖4E、4F，藍(lán)色箭頭所指)。不同濃度B.subtilis C1R32發(fā)酵上清液處理后的病原菌菌絲生長(zhǎng)均被抑制，并且發(fā)酵上清液含量較高時(shí)菌絲損傷較嚴(yán)重。
圖4不同濃度Bacillus subtilis C1R32無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響
2.5.2拮抗菌對(duì)病原菌糖原積累的影響
利用KI-I2染色評(píng)估B.subtilis C1R32對(duì)S.sclerotiorum PZ-2糖原積累的影響。結(jié)果顯示，KI-I2染色后，對(duì)照組PZ-2菌絲顏色隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而加深(圖5中A2)，對(duì)峙培養(yǎng)的PZ-2菌絲顏色隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越淺(圖5中B2)，而且均比對(duì)照組顏色淺。此外，對(duì)峙培養(yǎng)的PZ-2菌絲細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞破碎呈空殼狀(圖5，綠色箭頭所指)，隔膜明顯增寬(圖5中B1，藍(lán)色箭頭所指)，并且隨著對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲損傷程度逐漸增加，而對(duì)照組PZ-2菌絲并未出現(xiàn)明顯損傷，結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)均勻(圖5中A1)。上述結(jié)果表明，B.subtilis C1R32影響S.sclerotiorum PZ-2糖代謝，使病原菌糖原積累量減少，同時(shí)影響S.sclerotiorum PZ-2細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使菌絲損傷。
圖5 Bacillus subtilis C1R32對(duì)Sclerotinia sclerotiorum PZ-2糖原積累的影響
2.5.3拮抗菌對(duì)病原菌胞內(nèi)活性氧的影響
通過(guò)DCFH-DA活性氧熒光探針染色測(cè)定B.subtilis C1R32對(duì)S.sclerotiorum PZ-2胞內(nèi)活性氧的影響，結(jié)果顯示，對(duì)照組菌絲呈現(xiàn)較弱綠色熒光(圖6中A2)；與C1R32對(duì)峙培養(yǎng)1、2、3 d的PZ-2菌絲熒光強(qiáng)度均強(qiáng)于對(duì)照組(圖6中B2)，對(duì)峙培養(yǎng)第2天的熒光最強(qiáng)，活性氧迸發(fā)后PZ-2菌絲出現(xiàn)損傷，呈現(xiàn)碎片狀，至第5天則無(wú)法觀察到熒光。此外，對(duì)照組菌絲均無(wú)明顯破損(圖6中A1)，而與C1R32對(duì)峙培養(yǎng)的PZ-2菌絲損傷(圖6中B1)?；钚匝跆结樔旧Y(jié)果表明在作用早期，B.subtilis C1R32促使S.sclerotiorum PZ-2活性氧水平升高，產(chǎn)生氧化脅迫，導(dǎo)致其細(xì)胞損傷。
圖6 Bacillus subtilis C1R32對(duì)Sclerotinia sclerotiorum PZ-2胞內(nèi)活性氧積累的影響
2.5.4拮抗菌對(duì)病原菌基因表達(dá)的影響
由于拮抗菌影響S.sclerotiorum PZ-2糖原合成、活性氧爆發(fā)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因此通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)S.sclerotiorum PZ-2糖代謝、抗氧化酶和細(xì)胞壁成分相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，對(duì)峙培養(yǎng)24 h后，S.sclerotiorum PZ-2的糖代謝相關(guān)基因有下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，Gene_9536(己糖激酶)相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的80.00%，Gene_7772(葡萄糖磷酸變位酶)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的34.00%，出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.001)；此外，病原菌的抗氧化相關(guān)基因會(huì)上調(diào)表達(dá)，其中Gene_5305(過(guò)氧化氫酶相關(guān)的免疫反應(yīng)性)表達(dá)量為對(duì)照組的3倍，Gene_4935(過(guò)氧化氫酶)表達(dá)量為對(duì)照組的3.4倍，均顯著上調(diào)(P<0.05)，Gene_1287(過(guò)氧化物酶體)的表達(dá)量顯著(P<0.001)下調(diào)為對(duì)照組的51.00%；S.sclerotiorum PZ-2細(xì)胞壁組分相關(guān)基因Gene_13(糖基轉(zhuǎn)移酶、纖維素酶)、Gene_622(細(xì)胞壁)的表達(dá)量與對(duì)照組相比分別上調(diào)了47.15%和78.75%，Gene_11361(幾丁質(zhì)合成酶2)的表達(dá)略有下調(diào)(圖7)?；虮磉_(dá)量分析結(jié)果表明，B.subtilis C1R32會(huì)影響S.sclerotiorum PZ-2糖代謝相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)S.sclerotiorum PZ-2抗氧化基因和細(xì)胞壁成分相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，這也與B.subtilis C1R32和S.sclerotiorum PZ-2對(duì)峙培養(yǎng)后的糖原染色和活性氧染色結(jié)果一致。
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