1.2.6噬菌體裂解譜的測(cè)定


取100μL噬菌體原液以1∶1分別與被調(diào)查的45株雞大腸埃希氏菌菌懸液吸附反應(yīng)15 min,雙層瓊脂法過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。


1.2.7噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)


(multiplicity of infection,MOI)的測(cè)定將宿主菌培養(yǎng)至OD600≈0.5(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，以固定的對(duì)數(shù)宿主菌液(100μL)，按照感染復(fù)數(shù)分別為0.000 000 1、0.000 001、0.000 01、0.000 1、0.001、0.01、0.1、1的比例加入相應(yīng)體積的噬菌體液并混勻，靜置吸附15 min，均補(bǔ)加LB液體培養(yǎng)基至2 mL，振蕩培養(yǎng)4 h。10 000 r/min離心10 min，取上清，10倍倍比稀釋后，與培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液混合吸附，用雙層瓊脂法測(cè)定上述比例培養(yǎng)液的噬菌體滴度，滴度最高者即為最佳MOI。


1.2.8噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定


將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液(100 ml)與噬菌體液按MOI=0.001混勻，并在靜置吸附20 min后補(bǔ)加LB至200 mL，此為時(shí)間0，37℃、160 r/min，在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、110 min、130 min、150 min、170 min、190 min、210 min，19個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取2 mL，離心、稀釋、吸附，做3次重復(fù)試驗(yàn)，每次2個(gè)平行，采用雙層瓊脂法測(cè)定噬菌體滴度，并根據(jù)滴度繪制噬菌體感染宿主菌的一步生長(zhǎng)曲線。


1.2.9噬菌體pH敏感性的測(cè)定


取100μL噬菌體液分別接種于900μL不同pH(pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0)的LB液中，37℃水浴孵育2 h，稀釋、吸附，用雙層瓊脂法測(cè)定噬菌體滴度。觀察噬菌體的生長(zhǎng)情況，繪制曲線。


1.2.10噬菌體耐熱穩(wěn)定性的測(cè)定


分別取300μL效價(jià)為5.5×109PFU/mL的噬菌體原液于若干滅菌離心管中，將之分別置于40、50、60、70、80℃條件下處理，在0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min、140 min、160 min、180 min，10個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣并迅速放置于4℃，稀釋、吸附、倒板，測(cè)定其不同溫度下、不同時(shí)間點(diǎn)噬菌體的滴度，繪制熱穩(wěn)定性曲線。


2結(jié)果


2.1噬菌體的分離與純化


本試驗(yàn)以45株雞大腸埃希氏菌與污水水樣共培養(yǎng)，采用雙層瓊脂平板法經(jīng)5次反復(fù)純化，在平板上生長(zhǎng)的噬菌斑形態(tài)、大小均單一，得到1株裂解性噬菌體，其噬菌斑形態(tài)和大小見圖1，噬菌斑呈透亮的圓形，直徑0.8 mm～1.1 mm，邊緣整齊無暈環(huán)，將此噬菌體命名為vB-EcoM-IME540。

圖1噬菌體vB-EcoM-IME540的噬菌斑形態(tài)


2.2噬菌體的電鏡形態(tài)


透射電鏡觀察結(jié)果，如圖2所示，噬菌體vB-EcoM-IME540的頭部呈橢圓形且尾部具有收縮性，頭尾被頸圈分開，頭大小約106.7 nm×73.3 nm，尾長(zhǎng)約140 nm×16.7 nm。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)在2011年發(fā)布的第9次報(bào)告中噬菌體的分類與命名標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體vB-EcoM-IME540屬有尾噬菌體目(Caudovirales)，肌尾噬菌體科(Myoviridae)。

圖2噬菌體vB-EcoM-IME540的透射電鏡照片


2.3噬菌體的核酸類型鑒定


噬菌體核酸瓊脂凝膠電泳結(jié)果，如圖3所示，噬菌體vB-EcoM-IME540的核酸只能被DNaseⅠ消化，卻不能被RNase A與Mung Bean Nuclease消化，表明該噬菌體核酸為雙鏈DNA(Double-stranded DNA,dsDNA)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.vB_EcoM-IME540核酸；2.DNaseⅠ；3.RNase A；4.Mung Bean Nuclease



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