2.5 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株細胞壁完整性的影響
AKP是一種位于細菌細胞壁和細胞膜之間的酶。當細胞壁完整性被破壞時,AKP就會滲出細胞外,因此可以通過測定菌懸液中的AKP活力來反映細菌細胞壁的完整。如圖4所示,液化沙雷氏菌SCB2649菌株在正常情況下,AKP活力在0.24金氏單位/100 mL。分別經0.5、1.0、2.0 MIC SCB2505代謝物處理后,菌懸液中的AKP活力上升至0.504、0.686、0.944金氏單位/100 mL(P<0.05)。可見,隨著代謝物濃度上升,細胞壁通透性增加,細胞壁的完整性已被破壞,導致AKP向胞外泄露越多,并呈現(xiàn)明顯的梯度依賴關系。革蘭氏陰性菌細胞壁中的脂多糖是細胞壁的重要成分,能夠控制細菌的營養(yǎng)吸收,抵抗外界有害刺激,維持細菌內環(huán)境穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn),乳酸等有機酸能降解脂多糖,從而破壞細胞壁。因此推測代謝物中的乳酸作用于液化沙雷氏菌的細胞壁,使得細胞壁完整性被破壞,導致胞外AKP活力上升,此推測與2.3節(jié)中代謝物主要抑菌物質為乳酸的論述相符。
圖4植物乳桿菌SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株AKP活力的影響
2.6 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌細胞膜完整性的影響
PI是一種膜不透性的熒光染料。當細胞膜的完整性被破壞時,PI能夠進入細胞與遺傳物質結合,發(fā)出紅色熒光。因此能夠通過熒光顯微鏡檢測PI熒光反映細胞膜的完整性。如圖5所示,PI染色后對照組基本無可觀測的熒光,0.5 MIC代謝物處理4 h的液化沙雷氏菌組發(fā)出零星的紅色熒光,而隨著代謝物質量濃度升高,紅色熒光逐漸增強。當質量濃度為2.0 MIC時,觀察到大量的紅色熒光,說明經過SCB2505代謝物處理后,液化沙雷氏菌的細胞膜被破壞,導致大量PI進入細胞與遺傳物質結合,發(fā)出紅色熒光。PENG研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌細菌素能夠透化細胞膜,促進細胞膜形成孔洞,使得細胞膜破損以殺死細菌。此外,LINLEY等認為,過氧化氫能夠氧化細胞膜的脂質和蛋白質,導致膜結構和功能受損。而乳酸具有親脂性,能夠透過細胞膜進入細菌體內,影響細菌正常代謝,從而影響細胞膜的合成。推測隨著代謝物濃度增加,液化沙雷氏菌的細胞壁完整性被破壞,植物乳桿菌SCB2505代謝物中的抑菌物質更好地與液化沙雷氏菌的細胞膜進行作用,最終破壞細胞膜完整性,增大細胞膜通透性。這些能夠進一步說明SCB2505代謝物能夠破壞細胞膜完整性,進而起到抑菌作用。
圖5不同代謝物濃度對液化沙雷氏菌SCB2649菌株細胞膜完整性的影響(熒光顯微鏡圖)
2.7植物乳桿菌SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌細胞形態(tài)的影響
用代謝物處理10 h后的液化沙雷氏菌SCB2649菌株菌體形態(tài)如圖6所示。對照組(圖6-a)菌體形態(tài)呈短桿狀,表面相對完整,沒有明顯皺紋和裂紋;經過0.5 MIC代謝物處理后,菌體表面相比對照組略顯粗糙(圖6-b)。而經過1.0 MIC代謝物處理后,菌體表面褶皺萎縮,凹陷(圖6-c),而2.0 MIC處理組菌體與1 MIC處理組相比,其菌體萎縮、干癟更為明顯,部分菌體被溶解(圖6-d)。
a-對照組;b-0.5 MIC代謝物處理組;c-1.0 MIC代謝物處理組;d-2.0 MIC代謝物處理組
圖6植物乳桿菌SCB2505代謝物對指示菌表面超顯微結構的影響
植物乳桿菌SCB2505代謝物濃度較低時,乳酸等有機酸進入液化沙雷氏菌SCB2649菌株,初步解離細胞壁,細菌表面從光滑變得粗糙。而隨著代謝物濃度的上升,細胞壁破壞性加深,代謝物中的細菌素、過氧化氫、乳酸進一步破壞細胞膜完整性,細胞內容物滲出導致菌體表面出現(xiàn)凹陷和皺縮的現(xiàn)象發(fā)生。表明SCB2505代謝物可以破壞液化沙雷氏菌的細胞壁與細胞膜的完整性,導致胞內物質外泄,菌體皺縮。此結論與上述細胞壁、細胞膜完整性實驗結果一致。
3結論
植物乳桿菌SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌SCB2649菌株具有較好的抑菌活性,乳酸濃度、過氧化氫酶和蛋白酶對于其抑菌活性均具有顯著影響,推測抑菌物質是乳酸、細菌素與過氧化氫的復合物。植物乳桿菌SCB2505代謝物通過抑制液化沙雷氏菌生物被膜的合成,破壞其細胞壁和細胞膜的完整性,增加膜的通透性,使胞內物滲出,菌體表面逐漸凹陷皺縮,甚至裂解死亡。但目前的研究沒有深入探究植物乳桿菌SCB2505代謝物的物質組成,也無法解釋代謝物中有效抑菌成分對于液化沙雷氏菌SCB2649菌株的深層控制機制,后續(xù)研究將采用色譜和組學方法,從分子層面探究植物乳桿菌SCB2505代謝物的物質組成和有效抑菌成分,并進一步闡明植物乳桿菌SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌的抑菌機制。
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