1材料與方法


1.1試驗(yàn)材料


1.1.1細(xì)胞、病毒及營(yíng)養(yǎng)素


豬流行性腹瀉病毒（PEDV，YN株），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；3D4/21細(xì)胞，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；ML，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。


1.1.2主要試劑


主要試劑見(jiàn)表1。

1.1.3主要儀器


主要儀器見(jiàn)表2。

1.2方法


1.2.1試劑的配制


細(xì)胞完全培養(yǎng)液：在RPIM 1640培養(yǎng)液中添加1%青鏈霉素混合液(penicillin-streptomycin solution，PSF)、10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%非必需氨基酸（終濃度1 mol/L）和1%丙酮酸鈉（終濃度1 mmol/L）。


表2主要儀器


DMEM定制培養(yǎng)液：用DMEM粉末配制，添加血清和PSF，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH為7.2~7.4。主要成分見(jiàn)表3。


1.2.2 ML對(duì)3D4/21細(xì)胞活性的影響


①細(xì)胞處理。將細(xì)胞濃度調(diào)為1.2×104個(gè)/mL（此時(shí)用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液），調(diào)好的細(xì)胞懸液用排槍加到96孔板，每孔0.1 mL，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。等到96孔板的細(xì)胞長(zhǎng)至20%左右時(shí)，吸出原有的培養(yǎng)基，用PBS洗2遍細(xì)胞后，換成含不同濃度的ML（0、0.5、1、10、20、50μmol/L）的培養(yǎng)液（不同濃度的ML培養(yǎng)液用2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液配制），每個(gè)濃度水平10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)一個(gè)孔。放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天換液，等某組處理的細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，吸出培養(yǎng)基，PBS洗2遍后，再每孔加0.1 mL配制好的含10%CCK-8的定制培養(yǎng)基，并設(shè)置只含10%CCK-8 0.1 mL的無(wú)細(xì)胞組作為陰性對(duì)照組。加入試劑后再培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。


②計(jì)算細(xì)胞活性。


細(xì)胞活性（%）=（試驗(yàn)組OD值-陰性對(duì)照組OD值）/（空白對(duì)照組OD值-陰性對(duì)照組OD值）×100試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-wayANOVA和Duncan’s多重比較，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。


1.2.3 PEDV在3D4/21細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線


①細(xì)胞培養(yǎng)液。基礎(chǔ)RPMI 1640培養(yǎng)液再補(bǔ)加1%PSF、1%非必需氨基酸（終濃度1 mmol/L）和1%丙酮酸鈉（終濃度1 mmol/L）。


②細(xì)胞處理。將細(xì)胞培養(yǎng)液的濃度調(diào)整為2.2×105個(gè)/mL，鋪6板24孔板，每孔2 mL。設(shè)置空白組和PEDV組，空白組加1 mL的培養(yǎng)基，PEDV組細(xì)胞加1 mL病毒稀釋液（即病毒原液按20倍稀釋，原液104.5 TCID50），每組設(shè)4個(gè)重復(fù)；病毒吸附1 h后棄去液體，再添加2 mL培養(yǎng)液，從放回培養(yǎng)箱起開(kāi)始計(jì)時(shí)，在0、6、12、24、36、48 h每個(gè)時(shí)間點(diǎn)拿出一板，放在-80℃冰箱反復(fù)凍融3次（使得細(xì)胞中的病毒全部裂解到上清液中），取上清液待測(cè)。


③病毒基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定方法。用TRIzol法提取細(xì)胞上清液的總RNA，在保證樣品質(zhì)量合格的情況下，先反轉(zhuǎn)成cDNA，然后用熒光定量PCR儀檢測(cè)3D4/21細(xì)胞中病毒基因PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N的相對(duì)表達(dá)水平。以HRPT1作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析及表達(dá)量的計(jì)算參考Fu等。引物序列見(jiàn)表4。


1.2.4 ML對(duì)PEDV感染3D4/21細(xì)胞基因表達(dá)的影響


①細(xì)胞處理。鋪4板24孔板，每孔加入500μL細(xì)胞培養(yǎng)液（密度為2.2×105個(gè)/mL）。根據(jù)ML的添加時(shí)間點(diǎn)不同，分為兩種處理方式（全時(shí)添加ML和PEDV感染細(xì)胞后添加ML）。每種處理方式有3組（control組、PEDV組、PEDV+ML組），每組4個(gè)重復(fù)。


細(xì)胞長(zhǎng)滿單層棄去完全培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍。

表3 DMEM定制培養(yǎng)液配方成分


處理方式1：全時(shí)添加ML。


control組和PEDV組加入500μL的RPMI 1640培養(yǎng)液，PEDV+ML組加入500μL含ML（濃度為10μmol/L）的RPMI 1640培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后，PEDV組和PEDV+ML組加入PEDV病毒稀釋液，待病毒吸附1 h后，棄去細(xì)胞上清液。control組和PEDV組每孔加入500μL RPMI 1640培養(yǎng)液，PEDV+ML組每孔加入500μL含ML（濃度為10μmol/L）的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h。

表4基因的引物序列


處理方式2：PEDV感染細(xì)胞后添加ML。PEDV組和PEDV+ML組加入PEDV病毒稀釋液。病毒吸附1 h后，棄去細(xì)胞上清液。control組和PEDV組每孔加入500μL RPMI 1640培養(yǎng)液，PEDV+ML組每孔加入500μL含ML（濃度為10μmol/L）的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h。


②基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定方法。處理結(jié)束后收集細(xì)胞，提取RNA，檢測(cè)不同處理方式3D4/21細(xì)胞PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N、IL-6、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1、IFITM3、MMP13、KCNJ13等基因的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表4，以HRPT1作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析及表達(dá)量的計(jì)算參考Fu等的方法。


試驗(yàn)數(shù)據(jù)


用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-wayANOVA和Duncan’s多重比較，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。


十二酸單甘油酯對(duì)PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（一）

十二酸單甘油酯對(duì)PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（二）

十二酸單甘油酯對(duì)PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（三）

十二酸單甘油酯對(duì)PEDV感染3D4/21巨噬細(xì)胞活性、基因表達(dá)的影響（四）

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