摘要：為明確調理牛排的優(yōu)勢腐敗菌并篩選出抑菌性、專一性強的植物精油，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)基法結合聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術篩選出調理牛排的優(yōu)勢腐敗菌，并通過抑菌圈、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度及細菌生長曲線，從丁香精油、豆蔻精油、黑胡椒精油中選出抑菌性最強的植物精油。結果表明：優(yōu)勢腐敗菌為深藍紫色桿菌（Janthinobacterium lividum）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）和熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）；丁香精油的抑菌圈直徑均大于10 mm，2～4μL/mL的精油添加量就能明顯抑制優(yōu)勢腐敗菌的生長繁殖；豆蔻精油抑菌性稍弱；黑胡椒精油對3株優(yōu)勢腐敗菌均無明顯抑菌效果。


調理牛排烹飪簡單、方便快捷、營養(yǎng)美味，備受消費者青睞，然而，在其加工及銷售過程中，由于自溶酶和微生物的作用，會不斷積累醛、酮、胺等有害物質，導致牛肉顏色、質地、氣味發(fā)生劣變，不適宜消費者食用。在肉類微生物菌群中，優(yōu)勢腐敗菌能夠在低溫和長時間貯藏條件下大量增殖，占據(jù)主導地位，最終導致食品腐敗。


目前，傳統(tǒng)培養(yǎng)基分離仍是篩選優(yōu)勢腐敗菌最常見的方法，但其分離出的菌株往往不能代表微生物菌群的真實分布情況。聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術可以通過監(jiān)測微生物菌群組成變化判斷樣本中的優(yōu)勢菌，常用于研究白酒釀造、陳醋醋醅、土壤中的微生物菌群結構及種群分析，但該技術無法檢測出DNA含量＜1.5%的物種，在全面揭示菌群多樣性上具有一定局限性。已經(jīng)有學者通過MRS平板分離結合PCR-DGGE技術監(jiān)測真空包裝豬肉的貯藏期，得到了優(yōu)勢菌群（清酒乳桿菌）。因此，傳統(tǒng)培養(yǎng)基結合PCR-DGGE技術確定調理牛排中的優(yōu)勢腐敗菌，進行特異性防腐是解決其貨架期較短的有效措施。


植物精油是從種子、花、莖、葉、果實中提取的具有特征香氣的揮發(fā)性液體，具有很強的生物活性，可以抑制由腸沙門氏菌和大腸桿菌侵害及蛋白質和脂質氧化引起的食品腐敗、變質，是天然的抗菌劑和抗氧化劑，常被用來替代合成防腐劑。Manjankattil等發(fā)現(xiàn)，在火雞肉中添加辣椒精油能夠有效抑制其生產(chǎn)和加工過程中的耐藥沙門氏菌生長。Buckiuniene等用羅勒精油腌制牛肉糜，發(fā)現(xiàn)處理后的牛肉蒸煮損失和霉菌/酵母數(shù)量比值顯著降低，牛肉品質得到顯著提升。此外，Kasi等發(fā)現(xiàn)在花生油中添加具有強抗氧化活性（2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽離子自由基清除能力）的生姜精油，能降低其受黃曲霉毒素污染的風險，并有效延長保質期。然而，植物精油對調理牛排優(yōu)勢腐敗菌的抑菌性研究卻鮮有報道。


基于此，本研究擬通過傳統(tǒng)培養(yǎng)基法結合PCRDGGE技術驗證調理牛排貯藏期間的優(yōu)勢腐敗菌，并引入丁香精油（clove essential oil，CEO）、豆蔻精油（cardamom seeds essential oil，CSEO）及黑胡椒精油（blank pepper essential oil，BPEO），以期通過抑菌實驗篩選出一種高效、精準抑菌的植物精油，為調理牛排的特異性防腐提供理論參考。


1材料與方法


1.1材料與試劑


冷鮮調理牛排（牧童村菲力牛排）購于石河子市友好超市。


PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MRS、STAA、CFC固體培養(yǎng)基、PCA技術瓊脂培養(yǎng)基、VRBA結晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；瓊脂（分析級）國藥集團化學試劑有限公司；細菌DNA提取試劑盒（50 preps）、2×Taq Master Mix北京天根生化科技（化工）有限公司；CEO、CSEO、BPEO多特瑞商貿(mào)有限公司；Gel-Green DNA染色劑、TE緩沖液上海麥克林生化科技股份有限公司；1×TAE電泳緩沖液美國賽默飛世爾科技公司。


1.2儀器與設備


LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療機械廠；S100 Themal Cycler PCR擴增儀、UniversalHood11凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；ZHWY-118落地普通型大容量恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司；DCodeTM System DGGE儀孚約生物科技（上海）有限公司；C h e m i S c o p e 6100化學發(fā)光儀上海勤翔科學儀器有限公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡奧林巴斯（中國）有限公司。


1.3方法


1.3.1腐敗微生物的分離純化


無菌條件下稱取調理牛排20 g，放入裝有180 mL生理鹽水的均質袋中。密封后于拍擊式均質器中破碎，每20 min停歇10 min，避免過熱，重復2次。取1 mL原液進行梯度稀釋，選取3個合適稀釋度的樣品分別涂布于各選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上大小、形狀、顏色不同的菌落，通過平板劃線法對其進行純化，得到單一菌落。各選擇性培養(yǎng)基的目標腐敗菌和培養(yǎng)條件如表1所示。

表1調理牛排腐敗菌的篩選培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件



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