2結(jié)果與分析
2.1生長曲線的測定結(jié)果
圖1 2株腸道菌生長曲線
由圖1可知，2株菌0～3 h均顯示生長相對遲緩，6～24 h菌株呈指數(shù)生長，24～39 h菌數(shù)平穩(wěn)，39 h后活菌數(shù)開始減少進入衰亡期。此外圖1還顯示2種菌在21 h之前的增殖速率基本相同，但從21 h開始進入生長平穩(wěn)期間后，LJ-Q2較LJ-G1增殖速率快，39 h后LJ-Q2較LJ-G1衰亡速率快。研究結(jié)果對于后續(xù)發(fā)酵法制備雌馬酚有實際參考作用。
2.2金屬鹽對腸道菌生長的影響
2.2.1不同濃度金屬鹽對LJ-G1腸道菌生長的影響
圖2不同濃度金屬鹽對LJ-G1腸道菌生長的影響
由圖2可知，5種金屬鹽的不同濃度對LJ-G1菌生長均有不同程度的影響，運用F檢驗的方法，對各種差異進行統(tǒng)計學分析得知：Na2CO3濃度在0.3 mol/L之前與對照組比其影響無顯著差異（P＞0.05），不具有統(tǒng)計學意義，但0.5 mol/L與0.3 mol/L相比呈明顯的抑制作用（P＜0.05）；CaCl2濃度0.1 mol/L與0.5 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），濃度愈大抑制作用愈強，具有統(tǒng)計學意義；KNO3這5個濃度的影響比較一致；ZnSO4濃度為0.3 mol/L時抑制作用最小，0.3 mol/L分別與0.1 mol/L和0.5 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義；MnSO4濃度為0.1 mol/L時抑制作用相對較小，與0.5 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義。由圖2還可知，與對照組比較，5種金屬鹽對LJ-G1菌生長的抑制作用由弱到強依次為Na2CO3＜CaCl2＜KNO3＜ZnSO4＜MnSO4。
2.2.2不同濃度金屬鹽對LJ-Q2腸道菌生長的影響
圖3不同濃度金屬鹽對LJ-Q2腸道菌生長的影響
由圖3可知，5種金屬鹽的不同濃度對LJ-Q2菌生長也均有不同程度的影響。運用F檢驗的方法，對各種差異進行統(tǒng)計學分析得知：Na2CO3對LJ-Q2菌的影響結(jié)果同于LJ-G1菌；CaCl2濃度由0.1～0.3 mol/L抑制作用顯著增強（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義；KNO3的影響與CaCl2相似；ZnSO4濃度0.1 mol/L與0.2 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義，即濃度在0.2～0.4 mol/L之間抑制作用較小；MnSO4濃度0.1 mol/L與0.2 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義，濃度在0.2 mol/L時抑制作用相對較小，其后隨濃度增大抑制作用更強。
總體來看，5種金屬鹽對2種產(chǎn)雌馬酚腸道菌的生長均有抑制作用，最強的為MnSO4。在菌的培養(yǎng)增殖期間應(yīng)防止金屬污染。
2.3不同碳源對腸道菌生長的影響
圖4不同碳源對腸道菌生長的影響
由圖4可知，5種糖對兩株菌生長促進作用的影響從大到小依次為：葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞蔗糖＞果糖，與對照組相比葡萄糖最明顯，其次是麥芽糖和乳糖。運用F檢驗的方法，對各種差異進行統(tǒng)計學分析，蔗糖的影響與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），不具有統(tǒng)計學意義，果糖的影響呈抑制作用與對照組相比差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義，與果糖不易被微生物分解有關(guān)，這可能是蔗糖影響作用不明顯的緣故。大量體外研究表明，葡萄糖可作為腸道菌的有益碳源，而其他有害菌體不能利用或代謝利用率很低，這一結(jié)果可指導(dǎo)在以發(fā)酵法制備雌馬酚時，添加葡萄糖作為營養(yǎng)物質(zhì)，使產(chǎn)雌馬酚菌增殖提高其產(chǎn)量。
2.4單因素試驗結(jié)果
2.4.1葡萄糖質(zhì)量濃度對腸道菌生長的影響
圖5不同葡萄糖質(zhì)量濃度對腸道菌生長的影響
在pH 7、NaCl質(zhì)量濃度為4 g/L時，改變葡萄糖質(zhì)量濃度分別為1、3、5、7、9 g/L，考察不同葡萄糖質(zhì)量濃度對腸道菌生長的影響，結(jié)果見圖5。LJ-G1和LJ-Q2菌株菌落數(shù)在葡萄糖質(zhì)量濃度為1～7 g/L時呈上升趨勢，當葡萄糖質(zhì)量濃度為7 g/L時活菌數(shù)量值達到最大，此后隨質(zhì)量濃度增高，活菌落數(shù)快速下降，原因是滲透壓升高，不利于菌的生長。葡萄糖對LJ-Q2菌的影響高于LJ-G1菌。
2.4.2 pH值對腸道菌生長的影響
圖6 pH值對腸道菌生長的影響
在葡萄糖質(zhì)量濃度為7 g/L、NaCl質(zhì)量濃度為4 g/L時，改變pH值分別為4、5、6、7、8，考察pH值對腸道菌生長的影響，結(jié)果見圖6。LJ-G1和LJ-Q2菌落數(shù)在pH 4～6時呈上升趨勢，在pH值為7時達到最高，之后呈下降趨勢，可以判定菌種在pH 7時是菌落的最適生長pH值環(huán)境，本結(jié)果符合正常人體腸道內(nèi)為pH 6.8～7.3之間，在此范圍選擇不同水平進行正交試驗。
2.4.3滲透壓對腸道菌生長的影響
圖7 NaCl質(zhì)量濃度對腸道菌生長的影響
在葡萄糖質(zhì)量濃度為7 g/L、pH值為7時，改變滲透壓（NaCl質(zhì)量濃度）分別為2、4、6、8、10 g/L，考察滲透壓對腸道菌生長的影響，結(jié)果見圖7。LJ-G1和LJ-Q2活菌數(shù)隨NaCl質(zhì)量濃度的升高而增大，NaCl質(zhì)量濃度為4 g/L時達到最大，超過4 g/L之后活菌數(shù)明顯呈下降趨勢，且下降幅度較大。原因是隨NaCl質(zhì)量濃度的繼續(xù)增高，會提高環(huán)境的滲透壓從而使菌不能繼續(xù)生長，由此可知NaCl適宜質(zhì)量濃度為4 g/L左右。
從以上試驗得到兩種腸道菌3個因素最適水平范圍一致，故生長條件的優(yōu)化只選擇LJ-Q2菌株進行試驗。
2.5腸道菌生長條件的優(yōu)化
表1腸道菌生長條件L9（34）正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果
由表1可知，根據(jù)極差計算得到因素主次順序為：B＞C＞A，即pH值＞NaCl質(zhì)量濃度＞葡萄糖質(zhì)量濃度。計算分析因素水平優(yōu)組合為A3B3C1，不同于正交試驗中指標最高的第5組A2B3C1，經(jīng)驗證實驗兩組結(jié)果分別為11.52μg/mL與11.89μg/mL，顯著差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計學意義，確定優(yōu)組合為A2B3C1，即葡萄糖質(zhì)量濃度7 g/L、pH 7.2、NaCl質(zhì)量濃度2 g/L。
表2方差分析表
由表2方差分析可知，B因素的F值大于F臨界，這說明pH值對雌馬酚產(chǎn)量的影響顯著（P＜0.05）。A因素和C因素的F值均小于F臨界，這說明葡萄糖質(zhì)量濃度和NaCl質(zhì)量濃度對雌馬酚產(chǎn)量的影響不顯著。
3結(jié)論
通過對從素食者糞便中分離出的產(chǎn)雌馬酚LJ-G1和LJ-Q2兩株菌生長特性的研究發(fā)現(xiàn)，生長規(guī)律為37℃厭氧條件下，培養(yǎng)6 h后進入指數(shù)期、21 h后進入生長平穩(wěn)期、39 h后為衰亡期。MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3對2株菌的生長均有不同程度的抑制作用，其中MnSO4的作用最強。在對菌生長有促進作用的糖中，葡萄糖最明顯，其次是麥芽糖和乳糖。生長條件優(yōu)化得出（按培養(yǎng)基體積計）葡萄糖質(zhì)量濃度7 g/L、pH 7.2、NaCl質(zhì)量濃度2 g/L，雌馬酚產(chǎn)量11.89μg/mL。目前有關(guān)人體產(chǎn)雌馬酚腸道菌生長特性研究的相關(guān)報道幾乎未見到，今后還將依據(jù)素食者飲食特點在腸道環(huán)境方面，篩選影響產(chǎn)雌馬酚菌生長因素水平，進一步優(yōu)化指數(shù)期和延長平穩(wěn)期培養(yǎng)條件，為其最終實現(xiàn)體外采用生物發(fā)酵法制備雌馬酚奠定基礎(chǔ)。
素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌生長規(guī)律及生長條件優(yōu)化（一）
素食者產(chǎn)雌馬酚腸道菌生長規(guī)律及生長條件優(yōu)化（二）
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