摘要采用盆栽試驗，研究添加葡萄枝條對葡萄樹體生長及真菌結構的影響，評價修剪葡萄枝條循環(huán)再利用的可行性。以一年生“陽光玫瑰”葡萄為試材，分別添加不同比例的葡萄枝條，測定植株新梢長、新梢粗、葉面積、根系總體積等的變化，同時利用高通量測序技術研究土壤真菌群落結構的變化。門水平上，擔子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢類群。添加枝條處理降低了60，120，150 d時鏈格孢屬（Alternaria）、光黑殼屬（Preussia）、枝頂孢屬（Acremonium）、絲葚霉屬（Papulaspora）、新赤殼屬（Neocosmospora）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、毛殼屬（Chaetomium）、無莖真菌屬（Acaulium）、枝孢屬（Cladosporium）和間座殼屬（Diaporthe）的相對豐度。T2處理還降低了整個處理過程中葡萄穗霉屬（Stachybotrys）、Acrocalymma、Albifimbria、Gibellulopsis和曲霉屬（Aspergillus）等的相對豐度，并提高了60，90，150 d時小脆柄菇屬（Psathyrella）的相對豐度。添加適宜比例的葡萄枝條能夠提高葡萄新梢長和根系總體積。T2處理后150 d時新梢長是對照的1.2倍?？傊?，適量添加葡萄枝條優(yōu)化了土壤真菌群落結構，有利于木質素的降解，并形成對病原真菌抑制作用的土壤，降低葡萄感染病害的風險，T2處理在改善土壤真菌群落結構及促進樹體生長方面綜合表現最好。
在過去的幾十年中，為了提高農作物產量，在耕地上大量使用化肥、開展集約化生產以及增加負載量，這加速了對土壤的開發(fā)利用，導致土壤有機質減少，顯著改變了土壤微生物群落結構，造成土壤中原有有機碳損耗，與此同時，修剪等形成的廢棄植物殘體的清理，導致果園土壤返還的碳量較少。從長遠來看，這些因素將會導致土壤退化，引起作物產量降低。如果能合理利用這些修剪廢棄物產生的有機碳源，將有助于緩解土壤有機碳損失。因此，生產中應該采取適當的農藝措施，優(yōu)化土壤微生物群落結構，提高土壤有機質含量。
土壤微生物參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機碳的礦化固定，對土壤有機質和土壤團粒結構的形成具有直接作用，其群落結構在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)功能上具有重要意義，并最終影響植物的生長。植物殘體（修剪枝條、秸稈等）還田與土壤微生物之間是相互促進的關系。植物殘體作為有機改良劑對土壤微生物群落結構具有一定的重塑作用，能夠改變土壤活性有機碳組分，增加微生物生物量，促進土壤微生物活性的提高和養(yǎng)分循環(huán)，進而提高土壤的肥力水平。反之，土壤微生物又參與植物殘體的降解過程。土壤真菌在碳源轉化過程中發(fā)揮關鍵作用，可推動外源有機物的分解和腐殖化過程。
每年葡萄樹修剪都會產生大量廢棄枝條，這些枝條中含有豐富的有機質以及各種無機養(yǎng)分。然而，這些廢棄枝條常常被當作燃料直接燃燒，這樣不但會造成養(yǎng)分的浪費，而且燃燒過程中會產生致癌污染物。美國、澳大利亞、新西蘭等國家使用葡萄枝條堆肥覆蓋葡萄園，可以有效提高果實產量，降低果實含酸量，并提高果實鉀元素的含量。研究指出，在葡萄園中使用葡萄修剪廢料堆肥可以對土壤肥力、根系生長、產量和葡萄品質產生有益的影響。因此，如何對葡萄等果樹廢棄枝條進行合理化利用是目前生產中較為關注的問題。
葡萄枝條木質化嚴重，較難降解。自然界中真菌、細菌和放線菌均是降解木質素的微生物。其中，真菌可通過分泌胞外酶來完成降解，且降解能力最強。真菌介導的木質素降解主要引起側鏈氧化、去甲基化/去甲氧基化、芳香環(huán)斷裂等過程。然而，關于植物殘體還田的研究主要集中于秸稈還田，針對葡萄等木質化枝條還田對土壤微生態(tài)，尤其是對真菌群落結構影響的研究較少。不同植物殘體還田對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響不同，而這些差異被認為是由植物組織、碎屑數量和質量差異引起的。同樣得出，植物材料差異會影響土壤中碳源和養(yǎng)分循環(huán)的結論。添加的碳源從降解功能上對土壤微生物群落結構作出改變。因此，有必要對添加葡萄枝條后葡萄根域土壤微生物群落結構變化特征進行研究。
本試驗以一年生盆栽“陽光玫瑰”葡萄為試材，設計添加不同比例葡萄枝條處理，研究添加葡萄枝條對葡萄新梢生長、根系發(fā)育及土壤真菌群落結構等的影響，以期確定合適的葡萄枝條添加劑量。這既能為葡萄廢棄枝條處理提供一種可供選擇的方案，又能為葡萄枝條還田后土壤微生態(tài)變化提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料與處理
試驗于2019年3月至8月在天津農科院現代農業(yè)科技創(chuàng)新基地（北緯39°43'，東經116°96'）日光溫室完成。采用上海余昌園林工程有限公司生產的新60型銀杏牌枝條粉碎機（38.5 kW/380 V，700 mm×1 400 mm×1 300 mm）對一年生健康葡萄枝條進行粉碎。枝條粉碎后長為0.5~1.0 cm。為保證定植用栽培園土能夠真實準確反映陽光玫瑰葡萄根域土壤微生物代謝特征，這部分土壤取自園區(qū)內陽光玫瑰葡萄地塊土壤，清除該地塊凋落物、石塊和葡萄根系等雜質，混勻過篩備用。
栽培園土基本理化性質：速效氮40.95 mg/kg，速效磷32.06 mg/kg，速效鉀124.79 mg/kg，pH 7.35。將栽培園土與粉碎的葡萄枝條按照質量比為100∶1（T1），50∶1（T2），30∶1（T3），20∶1（T4）和10∶1（T5）的比例混合均勻，作為試驗盆栽基質，以園土栽培為對照（ck）。以一年生“陽光玫瑰”葡萄苗為試材，2019年3月選擇長勢一致、無病蟲害的優(yōu)質苗木定植于裝有上述混合基質的15 L營養(yǎng)缽內（上口徑30 cm，高度30 cm，底徑20 cm），常規(guī)管理。試驗包含6個處理，每個處理48株，共計288株苗木。分別于苗木定植后60，90，120，150 d收獲，用于各項指標的檢測。每個取樣時期每個處理隨機收獲12株，每4株為1次重復，共3次重復。
1.2土壤取樣方法
每個取樣時期將每個處理的12株苗木隨機分成3組（即3次重復），每組4株苗木，將每組的4株苗木去掉營養(yǎng)缽、松動土壤，然后去除根系、凋落物等雜質，過1 mm篩后充分混勻，作為一個土壤樣品重復（共計3次生物學重復）。每個生物學重復再按照四分法取樣分成3份，分別用于不同指標檢測。其中，2份用冰盒迅速帶回實驗室并保存在-80℃或4℃，用于土壤高通量測序及土壤酶活性分析，1份自然風干、研磨過篩后，用于土壤基本理化性質檢測。
1.3研究方法
采用CTAB法提取土壤樣品基因組DNA，委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成測序。對真菌ITS1區(qū)（Internal Transcribed Spacer1）進行PCR引物擴增。使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR。擴增引物為ITS1-1F-F（5'-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS1-1F-R（5'-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR產物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，對目的條帶采用Qiagen Gel Extraction Kit（Qiagen，Germany）進行回收。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit進行文庫構建，經過Qubit和Q-PCR定量后使用NovaSeq6000上機測序。下機數據截去Barcode和引物序列，采用FLASH（V1.2.7）拼接，利用Qiime（V1.9.1）質量過濾器過濾合并序列。通過UCHIME Algorithm與物種注釋數據庫比對，去除嵌合體序列獲得最終有效數據。利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）對上述最終有效數據進行聚類，按照97%的相似度將序列聚類成為OTUs（Operational taxonomic units）。最后，采用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析。每個土壤樣品3次生物學重復。
1.4數據統(tǒng)計與分析
所得數據采用IBM SPSS Statistics數據處理軟件進行統(tǒng)計分析。本試驗采用單因素完全隨機試驗設計。其中顯著性分析采用Duncan's多重比較法（P<0.05）。利用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、Venn圖、群落柱形圖和真菌屬水平相對豐度Heatmap圖，并進行主坐標分析（PCoA）。使用Microsoft Excel軟件繪制柱形圖。圖表中數據均為平均值±標準差。
葡萄枝條處理對土壤真菌群落結構、生態(tài)變化的影響（一）
葡萄枝條處理對土壤真菌群落結構、生態(tài)變化的影響（二）
葡萄枝條處理對土壤真菌群落結構、生態(tài)變化的影響（三）
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