副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于溫?zé)釒У貐^(qū)的近海海水、海底沉積物和魚貝類等海產(chǎn)品中。該菌是一種人畜共患菌，它能引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病的發(fā)生，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失[1]，同時(shí)也是人類食源性疾病重要病原之一。副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在世界各地區(qū)頻繁發(fā)生，以沿海城市為主[2]。它是亞洲許多國(guó)家引起食源性腸胃炎的主要病原菌[3]。我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)資料顯示[4-5]，副溶血性弧菌食物中毒居細(xì)菌性食源性致病之首?？股赝ǔ１徽J(rèn)為是治療此類疾病的良好藥劑，但隨著抗生素的大量使用該菌的耐藥性不斷增加。
1996年，美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)，疾病預(yù)防和控制中心(CDC)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)建立了國(guó)家耐抗菌素監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(NARMS)。表明微生物耐藥性是一個(gè)日趨嚴(yán)重的問題。世界衛(wèi)生組織(WHO)在2011年4月7日的世界健康日中強(qiáng)調(diào)微生物耐藥性的重要性[7]，呼吁積極采取措施應(yīng)對(duì)微生物耐藥性。我國(guó)是世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)已占住院感染總?cè)藬?shù)的30%左右。然而，各相關(guān)部門對(duì)食源性病原微生物抗菌藥耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究工作基本上沒有開展[8]。
因此，本研究的主要目的是，通過不同溫度下不同耐藥性致病副溶血性弧菌生長(zhǎng)特性的比較，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。同時(shí)，對(duì)這些菌株進(jìn)行ERIC-PCR分子分型，從基因型角度分析其變異性，另外，一級(jí)生長(zhǎng)模型的建立，為以后的耐藥性副溶血性弧菌的風(fēng)險(xiǎn)管理提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
胰蛋白胨大豆肉湯，TCBS培養(yǎng)基，Luria-Bertani營(yíng)養(yǎng)肉湯，Luria-Bertani營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Mueller Hinton Agar(MHA)英國(guó)OXOID。
抗生素:阿莫西林-克拉維酸(Amoxicillin-clavulanic acid)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢他啶(Ceftazidime)阿米卡星(Amikacin)、慶大霉素(Gentamicin)、四環(huán)素(Tetracycline)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、氯霉素(Chloramphenicol)，復(fù)方新諾明(Trimethoprim-Sulfamethoxazole)均由英國(guó)OXOID公司生產(chǎn)。
MLS-3750型高壓滅菌鍋三洋電機(jī)生物醫(yī)藥株式會(huì)社;SW-CJ-1FD系列超凈工作臺(tái)上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;Bioscreen FP-1100C型全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀芬蘭，Oy Growth Curves Ab Ltd公司。
1.2菌株的獲得
菌種:實(shí)驗(yàn)用的副溶血性弧菌菌株經(jīng)過PCR檢測(cè)其致病基因tdh，trh(方法參照GB/T4789.7-2008，F(xiàn)DA 2004 Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 9)。獲得的8株含有tdh基因的菌株用25%的甘油管保存，一份置于-20℃冰箱保存待用，一份置于-80℃冰箱保存。
1.3藥敏實(shí)驗(yàn)
菌株活化:將副溶血性弧菌菌株從-20℃保存的甘油管中經(jīng)活化后劃線至TCBS平板，37℃培養(yǎng)18～24h。從TCBS平板上挑取綠色的單菌落接種至10mL TSB(3%NaCl，pH8.0)中，放入搖床中，37℃，150r/min，培養(yǎng)18h，同時(shí)，三株質(zhì)控菌EscherichiacoliATCC25922、StaphylococcusaureusATCC25923和PseudomonasaeruginosaATCC27853經(jīng)活化后劃線至LBA平板，37℃培養(yǎng)，挑去單菌落至LB中搖床培養(yǎng)18h。
藥敏實(shí)驗(yàn):按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)規(guī)定[9]，K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的副溶血性弧菌菌株耐藥性進(jìn)行測(cè)定。首先將菌液調(diào)至濁度為1.5×108cfu/mL(OD值約為0.13)，用棉拭子蘸取一定量的菌液均勻涂布到約4mm厚度的MHA平板上，待干后，將帶有特定濃度的藥敏紙片貼于平板上。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h測(cè)量抑菌圈的直徑。副溶血性弧菌的敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。
1.4生長(zhǎng)參數(shù)的獲得
1.4.1生長(zhǎng)曲線測(cè)定將副溶血性弧菌菌株從-20℃保存的甘油管中活化后，劃線至TCBS平板，37℃培養(yǎng)18～24h。從TCBS平板上挑取綠色的單菌落接種至10mL TSB(3%NaCl，pH8.0)中，放入搖床中，37℃，150r/min，培養(yǎng)18h，菌株生長(zhǎng)到達(dá)指數(shù)后期(109CFU/mL)，以此為初始接種液。
采樣梯度稀釋法:在Bioscreen配套的100微孔板中進(jìn)行梯度稀釋。吸取初始接種液20μL接種至第一孔180μL TSB中，以此為第一稀釋梯度。用移液器吹吸混勻后，再?gòu)倪@個(gè)孔中吸取20μL接種至第二孔180mL TSB中，依次梯度稀釋到第5孔(104CFU/mL)TSB中，按相同方式做兩個(gè)平行，將加好菌液的100孔板放入Bioscreen的樣品槽中，Bioscreen的設(shè)置為每30min讀取一次，中速震蕩，吸光度為420～580nm的寬波段，培養(yǎng)溫度分別為20，25，37℃，分別測(cè)定這三個(gè)溫度下的生長(zhǎng)曲線，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
生長(zhǎng)曲線擬合分析采用OriginPro 8軟件，生長(zhǎng)參數(shù)數(shù)據(jù)比較采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。
表1藥敏紙片的中英文名稱及劑量
表2 8株菌株的耐藥結(jié)果
注:R表示耐藥;S表示敏感;I表示中介。
1.4.2應(yīng)用微生物預(yù)測(cè)模型采用修正的Gomperz growth model(1)[10]，用OriginPro8軟件擬合方程如下
y=α0+(α-α0)×exp(-exp(1+μmax×2.72×((λ-t)/(α-α0))))(1)
初始OD值為α0=0.12為104菌量時(shí)的OD值。α代表最大的生長(zhǎng)的OD值，λ代表延滯期(h)，μmax表示最大比生長(zhǎng)速率(h-1)
1.5 ERIC-PCR比較菌株的差異性
ERIC-PCR擴(kuò)增引物[11]Eric1:5′-TAAGCTCC TGGGATTCAC-3′、Eric2:5′-AAGTAAGTGACTGGGG TGAGCG-3′，由上海生物工程有限公司合成;PCR體系為:12.5μL的TaKaRa公司的Mix，引物(10μmol/L)各1μL、200ng DNA模板，用經(jīng)滅菌的去雙蒸水補(bǔ)齊25μL。ERIC-PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃7min、變性94℃1min、退火52℃1min、延伸65℃8min、總延伸65℃16min、10℃保存、30個(gè)循環(huán)。使用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，緩沖液為1×TAE，以120V恒壓電泳，電泳約60min后使用溴化乙錠染色15min后進(jìn)行成像觀察并保存。
ERIC-PCR圖譜分析以分子量大小相同的條帶作為相同性狀，陽(yáng)性結(jié)果記為1，陰性結(jié)果記為0，使用Gel-pro 4.5軟件分析，將輸出的結(jié)果以Dice為系數(shù)采用非加權(quán)平均法(UPGMA)利用SLT-Ntsy-2.10e軟件進(jìn)行聚類分析。
不同耐藥性致病副溶血性弧菌在20℃、25℃、37℃下的生長(zhǎng)曲線（一）
不同耐藥性致病副溶血性弧菌在20℃、25℃、37℃下的生長(zhǎng)曲線（二）
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