發(fā)酵肉制品是通過微生物發(fā)酵加工而成的具有獨(dú)特風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的肉類產(chǎn)品，其風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者喜愛，新產(chǎn)品的開發(fā)得到了越來越多的關(guān)注。發(fā)酵肉制品的方式分為自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵。葡萄球菌屬（Staphylococcus spp.）是一類具有球形或略微橢圓的革蘭氏陽性球菌，大多數(shù)為非致病菌，少數(shù)為致病菌。在肉制品發(fā)酵過程中，葡萄球菌常作為發(fā)酵劑，其安全特性始終是研究的重點(diǎn)，但是隨著人們健康意識的提高，一些新型功能的發(fā)酵特性也逐漸得到關(guān)注，例如降解膽固醇、生物胺等，這對發(fā)酵劑的篩選提出了更高的要求，因此需要發(fā)掘具備更多功能特性的葡萄球菌發(fā)酵菌株。
南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院的劉思露、陳姍姍、王虎虎*等以傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中篩選得到的33株葡萄球菌為研究對象，通過觸酶和硫化氫等基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)確定出11株菌進(jìn)入安全性能的篩選；通過溶血、血漿凝固酶和耐熱核酸酶等安全性指標(biāo)進(jìn)一步確定上述11株菌均符合要求；通過產(chǎn)脂肪酶、降解膽固醇、耐酸、產(chǎn)蛋白酶、降解肌原纖維蛋白、降解亞硝酸鹽、降解生物胺等功能性指標(biāo)篩選出安全性高、功能性全的發(fā)酵菌株，以期為篩選肉制品發(fā)酵劑提供一定的基礎(chǔ)。
1基礎(chǔ)生化指標(biāo)
33株葡萄球菌均為觸酶實(shí)驗(yàn)陽性，均含有過氧化氫酶。33株葡萄球菌中有11株硫化氫陰性，作為后續(xù)篩選的待測菌株。
2安全性指標(biāo)
本研究中，11株菌在血平板上生長正常，產(chǎn)生單菌落，均未產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，為溶血實(shí)驗(yàn)陰性。11株菌均未產(chǎn)生凝固現(xiàn)象，瓶體內(nèi)也未有凝塊產(chǎn)生，均為血漿凝固酶陰性。在甲苯胺藍(lán)-DNA酶培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生粉紅色暈圈，為耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)陰性。
3功能性指標(biāo)
3.1產(chǎn)脂肪酶
如圖1所示，有8株菌可產(chǎn)生脂肪酶，能夠分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸，使中性紅變色，在培養(yǎng)基中顯示紅色斑點(diǎn)。通過培養(yǎng)基顏色變化篩選出21株產(chǎn)脂肪酶的葡萄球菌發(fā)酵劑。
3.2降解膽固醇
膽固醇質(zhì)量濃度與吸光度的擬合公式為Y=0.004 78X-0.010 23（X為膽固醇質(zhì)量濃度（μg/mL），Y為560 nm波長處吸光度，R2=0.998 13），標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度R2＞0.99，擬合度較高，擬合程度較好。由圖2可知，8株菌均具有降解膽固醇的能力，其中沃氏葡萄球菌5F’-2降解率最高50.05%；琥珀葡萄球菌9P-3降解率相比于其他菌較低，為41.77%；兩株之間存在顯著差異（P＜0.05）。與參考文獻(xiàn)研究結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)中8株菌降解膽固醇能力較高，基本穩(wěn)定在40%～50%之間，因此選擇此8株菌繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.3耐酸
由圖3可得，實(shí)驗(yàn)中8株葡萄球菌更適合在偏中性環(huán)境生長，酸性條件會在一定程度上影響菌株的生長能力，相同時間內(nèi)隨著pH值的下降，菌液濃度逐漸下降，菌株進(jìn)入生長對數(shù)期的時間逐漸延后。
待測8株菌相對比，5F-2耐酸性能相對最強(qiáng)，A31、8A-1、5F’-2隨后，5D-1、C15、9N-1、9P-3耐酸性能較差。隨著pH值下降，5F-2雖生長速度減緩，對數(shù)期推遲，但是生長趨勢一直居首。A31、8A-1、5F’-2在pH 6.0時也表現(xiàn)出相對較強(qiáng)的耐酸性能，雖然相較于5F-2的耐酸性能不足，但是在酸性環(huán)境中可以生長。5D-1、C15、9N-1、9P-3對酸性環(huán)境較為敏感，在pH 6.5時即表現(xiàn)出相比于其他4株菌較弱的生長狀態(tài)，在pH 5.0時，連續(xù)5 d OD600 nm＜0.1，基本處于不生長的狀態(tài)。因此選擇5F-2、A31、8A-1、5F’-2耐酸性能較好的4株菌進(jìn)入后續(xù)的篩選。
3.4分解酪蛋白
本研究4株葡萄球菌在酪蛋白培養(yǎng)基上均形成了透明水解圈（圖4），說明4株菌均可產(chǎn)生蛋白酶分解酪蛋白，因此進(jìn)入下一步胞外蛋白酶活性的篩選，以探究葡萄球菌作為發(fā)酵劑能否降解肌肉蛋白。
3.5分解肌原蛋白
不同蛋白因分子質(zhì)量不同在SDS-PAGE圖中顯示出來，葡萄球菌胞外蛋白酶對雞肉肌原纖維蛋白降解作用結(jié)果如圖5所示。處理組中270、45 kDa和37 kDa左右的3個條帶發(fā)生了不同程度的降解。270 kDa左右的條帶可能是肌球蛋白重鏈，45 kDa左右的條帶可能是肌動蛋白，37 kDa左右的條帶可能是肌鈣蛋白。相比于空白對照組，4株菌的胞外蛋白酶在上述條帶中均發(fā)生了降解，條帶顏色變淺，說明對肌原纖維蛋白均產(chǎn)生了一定的降解作用，因此4株菌進(jìn)入下一步功能篩選。
本實(shí)驗(yàn)僅對上述篩選所得的4株葡萄球菌進(jìn)行了胞外蛋白酶降解雞肉肌原纖維蛋白能力的研究，值得注意的是蛋白質(zhì)的降解效果受多種因素影響，溫度、孵育時間均會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解效果的差異。另外不同種的葡萄球菌特性不一，不同來源的肌原纖維蛋白也可能會產(chǎn)生影響。
3.6降解亞硝酸鈉
亞硝酸鈉質(zhì)量濃度與吸光度的擬合公式為Y=0.006 57X＋0.021 31（X為亞硝酸鈉質(zhì)量濃度（μg/mL），Y為538 nm波長處吸光度，R2=0.999 1），標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度R2＞0.999，擬合度高，擬合程度好。由圖6可知，前述指標(biāo)中篩選出的4株菌均具有降解亞硝酸鹽的能力，其中沃氏葡萄球菌5F’-2降解率最高，為35.76%；琥珀葡萄球菌A31降解率相比于其他菌最低，僅為3.50%；4株菌降解亞硝酸鹽的能力相互之間存在顯著差異，但是亞硝酸鹽降解率可能會影響到肉制品色澤，因此不能單純的將降解率的高低作為唯一篩選標(biāo)準(zhǔn)，所以具有降解亞硝酸鹽的4株菌均保留到下一步篩選中。
3.7降解生物胺
本實(shí)驗(yàn)以腐胺、尸胺和組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化圖譜為參考，確定腐胺、尸胺和組胺的出峰位置，腐胺、尸胺和組胺分別于9.67、10.53、11.13 min分離出峰。20 min內(nèi)所有生物胺衍生物都被洗脫出來。在營養(yǎng)匱乏的情況下，具有氨基酸脫羧酶活性的細(xì)菌可能會將氨基酸脫羧形成對應(yīng)的生物胺改善生長環(huán)境，維持自身的正常生長。因此在PBS中只加入對應(yīng)的氨基酸檢驗(yàn)。結(jié)果可知，4株菌均不產(chǎn)生物胺。
3種生物胺（腐胺、尸胺、組胺）的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式分別為：Y腐胺=37 036.783 36 X-1 119.370 49（X為腐胺質(zhì)量濃度（μg/m L），Y為峰面積，R2=0.999 9）、Y尸胺=27 296.707 54X＋433.799 84（X為尸胺質(zhì)量濃度（μg/mL），Y為峰面積，R2=0.999 9）、Y組胺=20 047.998 12X-3 894.753 53（X為組胺質(zhì)量濃度（m g/m L），Y為峰面積，R2=0.9 9 9 9），R2≥0.999 9，擬合程度高，說明該方法成熟可靠，能夠定量分析這3種生物胺。由圖7可知，4株葡萄球菌中均能夠選擇性降解生物胺，均能降解腐胺和組胺，4株菌在降解腐胺能力上沒有顯著差異（P＞0.05），其中5F-2和5F’-2降解組胺能力較強(qiáng)，降解率達(dá)64%以上，且與另外兩株菌形成了顯著差異（P＜0.05），但是二者卻很少降解尸胺，5F’-2的尸胺降解率幾乎為0。A31和8A-1雖然對3種生物胺降解率沒有明顯優(yōu)勢，但是對3種生物胺均能均衡降解，在后續(xù)使用中需要根據(jù)具體的使用情景確定具體使用菌株，或與其他菌株復(fù)配使用。
4生長曲線
自動生長曲線分析儀測定的37℃條件下菌株生長曲線如圖8所示?？梢钥闯霭思?xì)菌生長周期中的遲緩期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，因測定細(xì)菌密度觀察不到衰亡期，即測定的48 h內(nèi)可能包括衰亡期，但衰亡期菌體出現(xiàn)死亡、活菌數(shù)量降低、活性減弱，對本實(shí)驗(yàn)研究意義不大。4株葡萄球菌在37℃條件下長勢良好，在4 h即進(jìn)入對數(shù)期，在10～20 h間即進(jìn)入穩(wěn)定期。
結(jié)論
首先通過常規(guī)基礎(chǔ)生化指標(biāo)和安全性指標(biāo)對33株葡萄球菌進(jìn)行篩選，共有11株菌進(jìn)入功能性篩選，確保了發(fā)酵菌株的安全；進(jìn)而通過降解脂肪、降解蛋白等傳統(tǒng)功能指標(biāo)和降解膽固醇、生物胺、亞硝酸鹽等新型功能性指標(biāo)結(jié)合進(jìn)行發(fā)酵特性分析和研究。最終選出沃氏葡萄球菌5F’-2、小牛葡萄球菌8A-1、沃氏葡萄球菌5F-2、琥珀葡萄球菌A31這4株葡萄球菌，均滿足觸酶實(shí)驗(yàn)陽性、不產(chǎn)硫化氫、不發(fā)生溶血現(xiàn)象、血漿凝固酶陰性、耐熱核酸酶陰性。上述菌株均可產(chǎn)生脂肪酶分解脂肪；均可降解膽固醇，且降解率較高，穩(wěn)定在40%～50%之間；能耐酸，在pH 5.0的環(huán)境下可生長；均產(chǎn)生蛋白酶，可降解肌原纖維蛋白；均可降解亞硝酸鈉，降解率排序?yàn)?F’-2＞8A-1＞5F-2＞A31；均能夠選擇性降解生物胺，均能降解腐胺和組胺。生長性能良好，可作為肉制品發(fā)酵菌株以便后續(xù)研究。
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