已有研究利用熒光染料HPF監(jiān)測抑菌化合物誘導(dǎo)的體內(nèi)熒光淬滅，我們進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)：在添加50%MIC濃度藥物3小時(shí)后監(jiān)測HPF熒光，該濃度和時(shí)間可保證野生型和突變體菌株100%存活。結(jié)果顯示，氯霉素（圖1B）、紅霉素和四環(huán)素等抑菌化合物不會引起惡臭假單胞菌及其突變體的HPF熒光淬滅，這與大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；野生型DOT-T1E在氨芐西林（圖1C）和諾氟沙星作用下出現(xiàn)HPF熒光淬滅。我們還檢測了T1E-18、T1E-PS28和雙突變體T1E-PS32的HPF熒光淬滅響應(yīng)：100μg/mL氨芐西林即可誘導(dǎo)DOT-T1E-18的淬滅反應(yīng)（圖1I），該濃度是野生型菌株發(fā)生淬滅所需最低濃度的1/3；雙突變體T1E-PS32在更低濃度（1/15）下即可誘導(dǎo)HPF熒光淬滅（圖1L）。這些結(jié)果表明，盡管基于HPF淬滅模式和親本菌株及突變體T1E-PS32的耐藥性特征，TtgGHI外排泵在氨芐西林排出中的作用較弱（圖1），但仍需將氨芐西林排出功能歸因于TtgGHI——因?yàn)閠tgABC/ttgGHI雙突變體在遠(yuǎn)低于T1E-18的氨芐西林濃度下即發(fā)生HPF熒光淬滅，且對多種抗生素的敏感性更高。
殺菌化合物并非通過產(chǎn)生活性氧殺死惡臭假單胞菌DOT-T1E
已有研究表明，體內(nèi)羥基自由基可淬滅HPF熒光；曾有觀點(diǎn)提出大腸桿菌中殺菌抗生素通過產(chǎn)生羥基自由基發(fā)揮普遍殺傷機(jī)制（無論其具體細(xì)胞靶點(diǎn)如何），依據(jù)是殺菌化合物（而非抑菌化合物）處理的細(xì)胞中會出現(xiàn)HPF熒光淬滅。但近期研究反駁了這一解釋，發(fā)現(xiàn)殺菌抗生素在無氧條件下仍可殺死大腸桿菌；與此一致，另有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌并非對所有殺菌化合物都產(chǎn)生活性氧。
我們的結(jié)果顯示，惡臭假單胞菌中殺菌和抑菌化合物引起的HPF熒光淬滅模式與上述大腸桿菌模式相似。我們進(jìn)一步檢測了氨芐西林處理后細(xì)胞是否激活氧化應(yīng)激響應(yīng)程序：通過轉(zhuǎn)錄組分析和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析多個氧化應(yīng)激基因的表達(dá)，提取暴露于300μg/mL氨芐西林的DOT-T1E細(xì)胞總RNA并進(jìn)行全局表達(dá)分析。結(jié)果顯示，氨芐西林處理后57個基因表達(dá)上調(diào)，22個基因表達(dá)下調(diào)，但未發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激相關(guān)基因在氨芐西林存在下被調(diào)控；相反，與一般應(yīng)激相關(guān)的基因（如recA和lexA）被誘導(dǎo)表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果，我們通過qRT-PCR定量分析了烷基氫過氧化物酶（T1E_5238）、過氧化氫酶（T1E_3279和T1E_4765）、過氧化氫酶過氧化物酶（T1E_1753）和recA基因的誘導(dǎo)水平：氨芐西林存在下生長的細(xì)胞中氧化應(yīng)激基因未被誘導(dǎo)（相對表達(dá)水平為0.88-1.4），而recA的表達(dá)上調(diào)了6倍。在對氨芐西林敏感性增強(qiáng)的惡臭假單胞菌DOT-T1E18中，氨芐西林處理也未誘導(dǎo)氧化應(yīng)激基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，氨芐西林不會導(dǎo)致活性氧（ROS）產(chǎn)生，也不會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激基因表達(dá)，但會誘導(dǎo)一般應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)基因。
吲哚是種間信號分子
DOT-T1E的基因組分析未發(fā)現(xiàn)色氨酸酶同源物。為驗(yàn)證DOT-T1E是否通過其他途徑產(chǎn)生吲哚，我們通過高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）分析了惡臭假單胞菌DOT-T1E在含或不含色氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長后的培養(yǎng)上清液，未發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌產(chǎn)生吲哚的跡象；而在大腸桿菌LK111的平行對照實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌在進(jìn)入穩(wěn)定期早期時(shí)產(chǎn)生的吲哚濃度可達(dá)400μM。
由于吲哚被描述為種內(nèi)信號分子，我們進(jìn)一步檢測了大腸桿菌與惡臭假單胞菌突變體共培養(yǎng)是否會影響該土壤細(xì)菌的抗生素耐藥性：在含色氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌LK111及其同基因tnaA（色氨酸酶）突變體，將過濾后的培養(yǎng)上清液作為吲哚來源，通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)檢測其對DOT-T1E、T1E-18和T1E-PS28抗生素耐藥性的影響（圖2）。
結(jié)果顯示，親本菌株（圖2A）和T1E-PS28（圖2A和C）在有無大腸桿菌培養(yǎng)上清液存在時(shí)的抗生素耐藥性水平相似；在無培養(yǎng)上清液或添加tnaA突變體上清液時(shí)，T1E-18的抑菌圈大于親本菌株，這種差異在替卡西林、氨芐西林和氯霉素作用下尤為顯著（圖2）；而添加大腸桿菌LK111上清液后，T1E-18對所有抗生素的耐受性增強(qiáng)，耐藥性水平與添加純吲哚時(shí)相當(dāng)。這表明腸桿菌產(chǎn)生的吲哚可有效促進(jìn)惡臭假單胞菌的抗生素耐藥性，通過監(jiān)測惡臭假單胞菌的生長曲線進(jìn)一步證實(shí)：200μg/mL氨芐西林可抑制DOT-T1E18的生長，而添加大腸桿菌上清液可緩解這種抑制效應(yīng)（盡管細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)期前存在短暫延遲，且生長速率比無抗生素時(shí)慢20%）（圖3）。
隨后，我們檢測了惡臭假單胞菌野生型、DOT1E-18與產(chǎn)吲哚大腸桿菌菌株在有無抗生素存在時(shí)的體內(nèi)生長情況：將大腸桿菌與各惡臭假單胞菌菌株以相同細(xì)胞密度（10^5 CFU/mL）接種到不含抗生素或含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，以各菌株單獨(dú)接種作為對照；通過在LB+氨芐西林+鏈霉素（大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基）上涂布計(jì)數(shù)大腸桿菌細(xì)胞數(shù)量，在LB+利福平上計(jì)數(shù)DOT-T1E，在LB+利福平+卡那霉素上計(jì)數(shù)T1E-18。結(jié)果顯示，8小時(shí)后共培養(yǎng)物達(dá)到穩(wěn)定期；在對照培養(yǎng)物和各共培養(yǎng)物中，大腸桿菌細(xì)胞密度均約為10^8 CFU/mL，DOT-T1E或T1E-18的細(xì)胞數(shù)量與之相近，表明無抗生素存在時(shí)各菌株的適應(yīng)性相當(dāng)。我們在300μg/mL氨芐西林存在下重復(fù)了上述共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：大腸桿菌因質(zhì)粒pMRS101攜帶bla基因而對該藥物耐藥，DOT-T1E菌株主要通過TtgABC泵排出抗生素而耐藥，而T1E-18菌株的生長則受氨芐西林抑制（見圖4）；結(jié)果顯示，只有當(dāng)培養(yǎng)基中存在大腸桿菌LK111時(shí)，T1E-18才能在氨芐西林存在下生長（圖4），表明種間信號傳導(dǎo)具有功能活性，且惡臭假單胞菌可通過識別大腸桿菌產(chǎn)生的化學(xué)信號在含抗生素的培養(yǎng)基中增殖。
相關(guān)新聞推薦
1、結(jié)核分枝桿菌蛋白Rv2029c促進(jìn)大腸埃希菌生長及糖酵解能力——摘要、材料與方法
2、動物雙歧桿菌NX-6生長曲線測定、斑馬魚降脂功效實(shí)驗(yàn)及促進(jìn)脂肪代謝機(jī)制研究（二）
3、地衣芽孢桿菌的生長曲線測定、生理生化特性、益生性能研究（二）