摘要
民族藥理學(xué)依據(jù)：貫葉連翹（Hypericum ascyron L.）作為一種傳統(tǒng)藥物，用于治療傷口、腫脹、頭痛、惡心、胃痛、膿腫、痢疾和慢性支氣管炎。需要進(jìn)行藥理學(xué)研究，為其傳統(tǒng)用途提供科學(xué)依據(jù)。本研究調(diào)查了貫葉連翹提取物的抗菌作用及其機(jī)制。
材料與方法：通過MTT法評(píng)估貫葉連翹提取物的抗菌活性。為了確認(rèn)貫葉連翹提取物對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的作用機(jī)制，進(jìn)行了Annexin V/碘化丙啶（PI）雙染色、TUNEL和DNA Laddering分析。
結(jié)果：測試了貫葉連翹提取物對(duì)陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抗菌效果，結(jié)果表明，貫葉連翹提取物的敏感菌主要包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌，尤其是藤黃微球菌。貫葉連翹提取物對(duì)藤黃微球菌的MBC值等于MIC值（20 mg/mL）。貫葉連翹提取物可通過凋亡途徑誘導(dǎo)藤黃微球菌細(xì)胞死亡。
結(jié)論：本研究為貫葉連翹的一些傳統(tǒng)用途和藥理學(xué)活性提供了科學(xué)支持。我們的數(shù)據(jù)為民間使用貫葉連翹提供了合理依據(jù)。
一、引言
細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性正在急劇增加，因此迫切需要開發(fā)新型抗菌藥物。許多從植物中提取的抗菌劑顯示出巨大的治療潛力。它們可以顯著減輕傳染病，但缺乏傳統(tǒng)抗菌劑常伴隨的不良副作用，包括超敏反應(yīng)、過敏反應(yīng)和免疫抑制。許多先前的研究已經(jīng)證明了傳統(tǒng)草藥代謝物對(duì)微生物的作用。特別是，金絲桃屬（Hypericum）是一個(gè)重要的屬，可以產(chǎn)生具有抗菌特性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。
貫葉連翹（Hypericum ascyron L.）屬于金絲桃科，是一種中藥，用于治療傷口、腫脹、頭痛、惡心、胃痛、膿腫、痢疾和慢性支氣管炎。最近的研究揭示了貫葉連翹藥理學(xué)活性的多種機(jī)制，包括抑制組胺釋放、抗炎和鎮(zhèn)痛作用、抗氧化活性、抑制葡萄糖苷酶、抗糖尿病活性、抗菌活性和抗腫瘤活性。然而，迄今為止，貫葉連翹抗菌作用的詳細(xì)機(jī)制尚未闡明。
凋亡是一種遺傳調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡形式，對(duì)于多細(xì)胞生物的發(fā)育和長期生存能力至關(guān)重要。凋亡發(fā)生在響應(yīng)各種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外刺激和壓力時(shí)。這些生理變化的累積效應(yīng)旨在誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、停止DNA修復(fù)和穩(wěn)態(tài)、滅活凋亡抑制蛋白、促進(jìn)超微結(jié)構(gòu)修飾并標(biāo)記垂死細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)生物分子結(jié)構(gòu)的解構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)容的分解和死亡標(biāo)記。
在本研究中，我們證明貫葉連翹提取物可以誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞死亡，并且這種效應(yīng)伴隨著DNA斷裂、膜電位耗散和結(jié)構(gòu)完整性的喪失，表明凋亡可能在貫葉連翹提取物誘導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞死亡過程中起關(guān)鍵作用。
二、材料與方法
2.1.植物材料
所有貫葉連翹樣品于2012年8月從中國內(nèi)蒙古自治區(qū)海拉爾市采集。所有標(biāo)本均由孫亞鴻（中國內(nèi)蒙古自治區(qū)根河市農(nóng)牧業(yè)局）鑒定。憑證標(biāo)本保存在中國天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院（標(biāo)本編號(hào)：HA20120806）。
2.2.提取
貫葉連翹提取物的提取過程按照我們之前的方法進(jìn)行。簡言之，收獲干燥植物的地上部分，然后過60目篩。準(zhǔn)確稱取每份樣品粉末（1.00克），使用30毫升6:4(v/v)的乙醇-水溶液，在30°C下超聲提取30分鐘。在5000g離心10分鐘后，將洗脫液在40±2°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，凍干，并儲(chǔ)存在-20°C。
2.3.HPLC分析
貫葉連翹提取物的HPLC分析按照我們之前的方法進(jìn)行。簡言之，使用由Agilent 1200系列泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵和1200系列紫外-可見二極管陣列（DAD）檢測器組成的HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。HPLC分離在Kromasil C18柱（250 mm x 4.6 mm i.d.;5μm）上進(jìn)行。使用乙腈（溶劑A）和含0.1%乙酸的水（溶劑B）作為流動(dòng)相。梯度洗脫程序如下：0至5分鐘，溶劑A從5%線性變化至10%；5至10分鐘，溶劑A從10%線性變化至15%；10至15分鐘，溶劑A從15%線性變化至17%；15至30分鐘，溶劑A在17%等度洗脫；30至60分鐘，溶劑A從17%線性變化至25%；60至90分鐘，溶劑A從25%線性變化至45%。
2.4.菌株
大腸桿菌（ATCC 25922）、陰溝腸桿菌（ATCC 13047）、肺炎克雷伯菌（ATCC 10031）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和藤黃微球菌（ATCC 10240）由中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）提供，并在Mueller-Hinton瓊脂（Hopebio，中國）中保存，儲(chǔ)存在-20°C。
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