摘要
諸如惡臭假單胞菌之類的微生物在有機(jī)廢物和有毒化合物的礦化中扮演重要角色。為了全面準(zhǔn)確地闡明惡臭假胞菌中尼古丁降解的關(guān)鍵過程，我們利用基于質(zhì)譜的譜圖計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)量了在以尼古丁或非抑制性碳源甘油生長(zhǎng)的惡臭假單胞菌S16中的差異蛋白質(zhì)豐度水平。計(jì)算機(jī)分析突顯了參與尼古丁降解功能途徑的蛋白質(zhì)的顯著聚類。通過定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析了差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們觀察到以下關(guān)鍵結(jié)果：(i) 包含1,292個(gè)觀測(cè)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組提供了尼古丁代謝所涉及酶的詳細(xì)視圖。這些蛋白質(zhì)可被歸類到轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒和氨基酸代謝等功能組。在尼古丁培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞，其胞質(zhì)蛋白質(zhì)模式存在顯著差異。(ii) 3-琥珀酰吡啶轉(zhuǎn)化為6-羥基-3-琥珀酰吡啶的關(guān)鍵步驟是由一個(gè)多酶反應(yīng)催化的，該反應(yīng)包含一個(gè)鉬蝶呤結(jié)合氧化酶(spmA)、一個(gè)鉬蝶呤脫氫酶(spmB)和一個(gè)(2Fe-2S)結(jié)合鐵氧還蛋白(spmC)，并以鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸作為輔因子。(iii) 克隆了一個(gè)新型尼古丁氧化還原酶(nicA2)的基因，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行了表征。本研究中鑒定的蛋白質(zhì)和功能途徑是降解環(huán)境有毒化合物的有吸引力的靶標(biāo)。
引言
惡臭假單胞菌屬于假單胞菌屬的非致病性成員，能夠代謝多種有機(jī)物質(zhì)圖1。HSP羥化酶(HspA或HspB)將HSP轉(zhuǎn)化為2,5-二羥基吡啶(DHP)和琥珀酸半醛[12,13]。惡臭假單胞菌S16通過中間體N-甲?；R來酰胺酸、馬來酰胺酸和馬來酸將DHP轉(zhuǎn)化為富馬酸，這是尼古丁降解途徑的后期步驟(圖1)。相關(guān)的四個(gè)基因，即2,5-DHP雙加氧酶基因(hpo)、N-甲?；R來酰胺酸脫甲?；富?nfo)、馬來酰胺酸酰胺酶基因(ami)和馬來酸順反異構(gòu)酶基因(iso)已在大腸桿菌中克隆并表達(dá)[14,15]。通過計(jì)算工具（如Glimmer和Blast同源性搜索）已生成了S16菌株整個(gè)基因組的初步注釋[16]。因此，有必要鑒定那些通過同源性建模不明顯的、能夠降解尼古丁的其他蛋白質(zhì)和途徑，并且應(yīng)該可以使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法來搜索涉及尼古丁分解代謝的調(diào)控和分子機(jī)制的蛋白質(zhì)。
盡管對(duì)尼古丁降解的科學(xué)重要性的認(rèn)識(shí)日益提高，但關(guān)于編碼SP羥基化和細(xì)菌中尼古丁轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因知之甚少。在過去幾年中，人們通過基因組文庫(kù)篩選和野生型酶純化付出了巨大努力來鑒定SP羥基化的關(guān)鍵基因。不幸的是，這些努力未能鑒定出任何與SP羥基化相關(guān)的基因。進(jìn)展可能需要開發(fā)綜合的實(shí)驗(yàn)方法。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法，可以觀察生物體合成和利用的整套蛋白質(zhì)產(chǎn)物[17]。它可以幫助我們準(zhǔn)確確定ORF的邊界和枚舉，并驗(yàn)證那些不能基于同源性很好確定的未知ORF。
在本研究中，我們分析了S16菌株的胞質(zhì)蛋白質(zhì)模式，該菌株含有尼古丁降解的必需基因，使用多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法和分子遺傳學(xué)。該蛋白質(zhì)組信息用于補(bǔ)充相應(yīng)蛋白質(zhì)子集的基因誘導(dǎo)和表達(dá)數(shù)據(jù)。通過MS/MS譜分析，以最佳得分（命中數(shù)>=5, 唯一性>=2）鑒定出總共1,292個(gè)蛋白質(zhì)。涉及轉(zhuǎn)運(yùn)、能量、解毒和應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)在尼古丁存在下上調(diào)。此外，暴露于尼古丁導(dǎo)致膜蛋白上調(diào)，包括孔蛋白、外膜蛋白和與溶劑外排泵相關(guān)的蛋白質(zhì)。本研究代表了對(duì)尼古丁降解中細(xì)胞反應(yīng)的全局分子表征的重要途徑。我們提供了SP羥化酶參與該途徑的證據(jù)，該酶由一個(gè)4.45 kb的基因簇編碼。該酶需要鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸作為輔因子。此外，我們描述了另一種尼古丁氧化還原酶(NicA2)，其與NicA1（先前稱為NicA）的氨基酸同一性較低(10.9%)[11]。刪除nicA2而非nicA1阻止了惡臭假單胞菌S16對(duì)尼古丁的分解代謝，證明了新發(fā)現(xiàn)的NicA2的重要性。構(gòu)建了四個(gè)缺失突變體，并表明這些酶NicA2、Mfs、Pnao和SpmABC對(duì)于尼古丁降解是必需的。據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道在假單胞菌菌株中定量研究尼古丁誘導(dǎo)的全局蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)變化。我們將比較蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)與分子遺傳學(xué)相結(jié)合的方法揭示了可能參與尼古丁降解的有趣的假單胞菌特異性蛋白質(zhì)。
尼古丁和甘油培養(yǎng)基中惡臭假單胞菌S16尼古丁降解的分子反應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定
為了揭示尼古丁降解中的分子途徑，我們獲得了參考條件（甘油作為唯一碳源和(NH4)2SO4作為氮源）與處理?xiàng)l件（尼古丁作為唯一碳源和氮源）之間蛋白質(zhì)表達(dá)變化的全局概覽。在LC-MS/MS測(cè)量階段獲得了尼古丁和甘油條件之間的直接比較。使用LTQ Orbitrap XL混合FTMS分析對(duì)肽段和相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量分析。每個(gè)條件（尼古丁或甘油作為培養(yǎng)基）測(cè)量三個(gè)獨(dú)立運(yùn)行，共使用六個(gè)生物樣品。通過MS/MS譜分析鑒定出總共1,292個(gè)通過得分（命中數(shù)>=5, 唯一性>=2）的蛋白質(zhì)（表S1）。這1,292個(gè)觀測(cè)到的蛋白質(zhì)代表了理論蛋白質(zhì)組（S16菌株的5,218個(gè)推定編碼序列，[16]）的25%。使用全局歸一化消除實(shí)驗(yàn)誤差，并對(duì)兩組蛋白質(zhì)之間進(jìn)行t檢驗(yàn)。只有變化倍數(shù)>=3倍且p值<0.05的蛋白質(zhì)才被報(bào)告為差異表達(dá)蛋白質(zhì)。根據(jù)這些預(yù)定義標(biāo)準(zhǔn)，126個(gè)推定蛋白質(zhì)在尼古丁和甘油培養(yǎng)基之間顯示出顯著的蛋白質(zhì)豐度變化（表S2和表S3）（圖S1和圖2）。根據(jù)S16菌株的整個(gè)基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)[16]，提供了惡臭假單胞菌S16環(huán)狀染色體的圖譜，說明了已知基因、預(yù)測(cè)編碼區(qū)、基因組島和差異表達(dá)蛋白質(zhì)的位置。
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