摘要


目的對(duì)肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kpn)Ⅵ型分泌系統(tǒng)(typeⅥsecretion system，T6SS)結(jié)構(gòu)基因vgrG進(jìn)行敲除，評(píng)估缺失vgrG后的細(xì)菌體外生長(zhǎng)能力和致病力。


方法根據(jù)NCBI公布的Kpn vgrG序列和前后基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出vgrG上下游同源臂序列并搭橋后克隆至載體pKO3-Km，重組載體導(dǎo)入Kpn感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)同源重組獲得vgrG缺失株ΔvgrG。通過(guò)PCR擴(kuò)增出vgrG啟動(dòng)子加完整基因片段并克隆至載體pBAD33，導(dǎo)入缺失株ΔvgrG感受態(tài)細(xì)胞獲得回補(bǔ)株CΔvgrG。將野生株WT、ΔvgrG株和CΔvgrG株在LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并比較生長(zhǎng)速度；不同菌株感染人肺上皮細(xì)胞A549比較黏附細(xì)胞能力；不同菌株感染小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7比較胞內(nèi)存活能力；不同菌株感染小鼠觀察小鼠的存活率(n＝10)和肺臟細(xì)菌數(shù)量(n＝6)。組間比較采用t檢驗(yàn)。


結(jié)果經(jīng)過(guò)同源重組獲得了ΔvgrG株，經(jīng)特異性引物鑒定相比WT株缺失了完整vgrG片段(2 487 bp)，并在此基礎(chǔ)上獲得了CΔvgrG株。Kpn缺失vgrG前后細(xì)菌的體外生長(zhǎng)能力沒(méi)有顯著變化[(1.40±0.10)vs(1.20±0.30)，t＝0.63，P>0.05]，WT株黏度顯著高于ΔvgrG株[(0.96±0.04)vs(0.38±0.05)，t＝9.72，P<0.05]，CΔvgrG株黏度也顯著高于ΔvgrG株(P<0.05)。細(xì)胞層面，野生株WT對(duì)A549細(xì)胞的黏附菌量顯著多于ΔvgrG株[(5 367.00±318.00)CFU vs(4 067.00±88.19)CFU，t＝3.94，P<0.05]，CΔvgrG株黏附菌量也顯著高于ΔvgrG株(P<0.05)。細(xì)菌感染12 h后，WT株在巨噬細(xì)胞中的存活率顯著高于ΔvgrG株[(69.00±1.00)%vs(47.50±2.50)%，t＝7.99，P<0.05]。動(dòng)物層面，致死劑量感染小鼠后WT株組存活率顯著低于ΔvgrG株組[(16.67±8.82)%vs(53.33±6.67)%，t＝3.32，P<0.05]；半致死劑量感染小鼠后WT株組小鼠肺臟細(xì)菌數(shù)顯著多于ΔvgrG組[(4.97±0.06)lg CFU/g vs(4.05±0.04)lg CFU/g，t＝12.27，P<0.01]，CΔvgrG株組小鼠肺臟細(xì)菌數(shù)也顯著多于ΔvgrG株組(P<0.01)。


結(jié)論vgrG不影響Kpn的體外生長(zhǎng)，但參與Kpn對(duì)上皮細(xì)胞的黏附、抵抗巨噬細(xì)胞殺傷和對(duì)小鼠的致病力。


肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kpn)是一種機(jī)會(huì)性病原體，可引起多種院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染，因其菌株的強(qiáng)特異性、廣泛的耐藥性和豐富的毒力因子庫(kù)，目前已成為公共衛(wèi)生的重大威脅。


細(xì)菌分泌系統(tǒng)是存在于細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu)，可使細(xì)菌與周圍環(huán)境交換信息以獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并運(yùn)輸效應(yīng)蛋白。因此，分泌系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)細(xì)菌與宿主之間的相互作用。目前，革蘭陰性菌中已發(fā)現(xiàn)9種不同的分泌系統(tǒng)，從Ⅰ型(typeⅠsecretion system，T1SS)到Ⅸ型(T9SS)。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)于2006年在霍亂弧菌中首次發(fā)現(xiàn)，T6SS是一種跨膜復(fù)合物，用于將效應(yīng)物遞送至宿主或靶細(xì)菌。其作用過(guò)程類似于噬菌體尾部收縮的穿刺機(jī)制，將裝有效應(yīng)物的針頭注入靶細(xì)胞，該系統(tǒng)的兩種重要蛋白質(zhì)：溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(hemolysin co-regulated protein，Hcp)和纈氨酸-甘氨酸重復(fù)G蛋白(valine-glycine repeat G，VgrG)是可以由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外的易位蛋白。


最近研究表明，T6SS可能在Kpn的毒力中發(fā)揮重要作用。而VgrG裝置蛋白對(duì)Kpn致病性的直接影響研究較少，本研究擬通過(guò)同源重組方法構(gòu)建Kpn vgrG缺失株并進(jìn)行體內(nèi)外生物學(xué)功能評(píng)價(jià)，探究vgrG對(duì)細(xì)菌致病性的影響，這將為理解Kpn T6SS與致病力的關(guān)系并發(fā)掘Kpn新的防治靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)資料。


材料和方法


1．生物材料：


高毒力K2血清型Kpn由蘇北人民醫(yī)院整形燒傷外科前期臨床分離并保存；大腸埃希菌DH5α及質(zhì)粒pKO3-Km、pBAD33由本科室保存；人肺上皮細(xì)胞A549和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7由本科室保存；6周齡BALB/c雌性小鼠購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2022-0009；嚴(yán)格按照揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行，本研究通過(guò)揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(202407013)。


2．主要試劑：


高保真PCR酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ、SalⅠ和KpnⅠ(日本TaKaRa)；同源重組連接酶(上海翌圣生物)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO)；其他的生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。


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