3、討論與結(jié)論
本研究廣泛收集全國(guó)各地水樣，以小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869為指示菌株，從浙江省寧波市北侖區(qū)路林市場(chǎng)下水道采集的表層水樣中分離純化了一株烈性噬菌體，可快速裂解宿主菌株，使渾濁的CICC 10869(1.5 h)、CICC 21669(2.5 h)和CMCC 52202(1.5 h)菌液裂解澄清。生物信息分析表明Yen-yong1非常新穎，代表以往未知的病毒進(jìn)化譜系，豐富了噬菌體知識(shí)庫(kù)。在Yen-yong1基因組中未發(fā)現(xiàn)毒力因子基因、耐藥基因和溶原相關(guān)基因，從基因水平上顯示其應(yīng)用的生物安全性。
截至目前，公共數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)中共公布了67株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體(表3)，其中在國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)的分類系統(tǒng)中有分類地位的有11株：分別屬于有尾綱Caudoviricetes的Autographiviridae科(7株)、Straboviridae科(3株)和Demerecviridae科(1株)。其他未分類的56株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體中，9株呈長(zhǎng)尾病毒樣(Siphovirus-like)形態(tài)，7株呈短尾病毒樣(Podovirus-like)形態(tài)，29株呈肌尾病毒樣(Myovirus-like)形態(tài)，11株形態(tài)未知?；蚪M最大的是262 391 bp(Yersinia phage phiR1-37)，最小的是34 966 bp(Yersinia phage YeP6)。
表3已公開(kāi)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體
以往對(duì)于分離獲得的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體大多具有嚴(yán)格的屬特異性或種特異性[41-46]。本研究使用8個(gè)不同科的65株供試菌來(lái)檢測(cè)Yen-yong1的宿主范圍。結(jié)果與以往的報(bào)道一致，Yen-yong1對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有嚴(yán)格的種特異性。這一特性使噬菌體只特異性地殺死靶標(biāo)病原菌，對(duì)非目標(biāo)菌株不會(huì)裂解。Yen-yong1在4株供試小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌株中可裂解3株，具有株廣譜性，有利于噬菌體的應(yīng)用。
Yen-yong1的暴發(fā)量(406.17 PFU/cell)大于以往報(bào)道的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體KFS-YE(38 PFU/cell)[42]、phiYeO3-12(120 PFU/cell)[41]、PY100(120 PFU/cell)[46]等，顯示其更強(qiáng)的增殖能力。
Yen-yong1對(duì)理化因子具有優(yōu)良的耐受性。在寬泛的溫度(-80-60℃)和pH范圍(2.0-13.0)下保持高水平溶菌活性。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌能在pH 4.2-9.0[7]和冷藏溫度下存活[3,6]，而噬菌體Yen-yong1良好的理化耐受范圍遠(yuǎn)超小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，這為研發(fā)高效的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體生物制劑奠定了基礎(chǔ)。以往報(bào)道的一些小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體，如Yersinia phage vB_Yen_X1和Yersinia phage KFS-YE也具有良好的pH耐受性，但均不如Yen-yong1。Yen-yong1對(duì)惡劣環(huán)境具有良好的耐受性，在極酸環(huán)境(pH 2.0)下處理2 h后滴度高達(dá)1.02×109 PFU/mL，在極堿環(huán)境(pH 12.0和pH 13.0)下處理2 h后滴度分別為3.09×108 PFU/mL和2.19×105 PFU/mL。Yen-yong1在0-3%的鹽濃度環(huán)境中能保持高溶菌活性(滴度>108 PFU/mL)，優(yōu)良的理化性質(zhì)為Yen-yong1的實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。CICC 10869在含5%以上鹽濃度的平板上無(wú)法生長(zhǎng)成可見(jiàn)菌苔，因而在噬菌體鹽度敏感性實(shí)驗(yàn)中Yen-yong1無(wú)法形成可見(jiàn)噬菌斑，但這并不意味著Yen-yong1無(wú)法耐受5%以上的鹽濃度，需要開(kāi)展進(jìn)一步研究以檢測(cè)其高鹽耐受性。
為了探討噬菌體適用儲(chǔ)存條件，開(kāi)展了噬菌體在-80、-20、4℃的長(zhǎng)期儲(chǔ)存試驗(yàn)與在-80、-20℃的凍融實(shí)驗(yàn)。Yen-yong1的滴度在實(shí)驗(yàn)時(shí)間(0-360 d)內(nèi)，-80℃或-20℃儲(chǔ)存時(shí)滴度基本保持恒定，4℃儲(chǔ)存時(shí)則緩慢下降；-80℃和-20℃儲(chǔ)存并反復(fù)凍融后滴度略有下降，但均在108 PFU/mL以上。結(jié)果顯示，分裝凍存能更好地長(zhǎng)期保持噬菌體的活性。
細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu)不僅能阻止藥物滲透到生物被膜內(nèi)部的細(xì)胞，還能抵抗宿主免疫系統(tǒng)，是細(xì)菌感染持續(xù)存在的主要原因之一[37]，是防治細(xì)菌感染需要解決的一個(gè)重要問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)噬菌體Yen-yong1對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生物被膜均具有破壞作用。噬菌斑周圍具有半透明暈圈，半透明暈圈是由噬菌體解聚酶基因的編碼產(chǎn)物造成的[21]。噬菌體解聚酶能降解細(xì)菌的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，幫助病毒顆粒吸附、侵入和裂解宿主菌。即使在生物被膜中，解聚酶也能發(fā)揮很好的作用[47]。噬菌體解聚酶已經(jīng)成為了預(yù)防和清除細(xì)菌生物被膜的一種潛在策略。雖然在Yen-yong1基因組中尚未發(fā)現(xiàn)已知的解聚酶基因，但實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其解聚酶活性。如結(jié)果所述，Yen-yong1代表以往未知的進(jìn)化譜系，其序列非常新穎，一些ORFs因現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)足夠參考基因而尚無(wú)法被注釋，其基因組中的解聚酶基因也很可能是新穎的，有待進(jìn)一步研究。
本研究不僅分析了Yen-yong1在不同MOIs下對(duì)生豬肉片中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的清除效果，還分析了Yen-yong1對(duì)生豬肉片中不同宿主菌的清除作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MOI=1-100時(shí)，MOI越高，Yen-yong1對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制效果越好。Yen-yong1對(duì)豬肉中3株供試小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌株顯示出良好的除菌效果。
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有耐冷性[6]，可在冷藏溫度(4℃)下增殖，因此耶爾森氏菌病也被稱為“冰箱病”。本研究發(fā)現(xiàn)，被試的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202在冷藏溫度下均可增殖，其中CMCC 52202的增殖能力尤為顯著。在冷藏24 h后，豬肉中的菌量增加了2.47 log10單位(表2)。噬菌體在冷藏條件下是否具有抑菌能力，以及能力的強(qiáng)弱，對(duì)于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌噬菌體的可應(yīng)用性至關(guān)重要。文獻(xiàn)報(bào)道Yersinia phage fHe-Yen9-01在4℃、MOI=105時(shí)對(duì)生豬肉的細(xì)菌清除率可達(dá)90.78%[48]。相比之下，Yen-yong1在4℃下表現(xiàn)出更為優(yōu)良的細(xì)菌清除力，在MOI=1、10和100時(shí)，對(duì)豬肉中CICC 10869的清除率分別高達(dá)91.21%、93.95%和98.28%；對(duì)CICC 21669和CMCC 52202的清除率分別為78.35%(MOI=100)和96.33%(MOI=100)。Yen-yong1的這一特性使其在冷藏條件下對(duì)食品的保護(hù)具有顯著優(yōu)勢(shì)。首個(gè)獲得FDA GRAS認(rèn)證的單增李斯特菌噬菌體制劑Listex?P100，可作為食品添加劑應(yīng)用于即食肉類和家禽產(chǎn)品。當(dāng)用量達(dá)到1×109 PFU/cm2時(shí)，Listex?P100可將豬牛肉、禽肉和水產(chǎn)品中的單增李斯特菌清除減少1.3-3.4 log10單位。若將Listex?P100的劑量每減少一個(gè)數(shù)量級(jí)，則其對(duì)食品中細(xì)菌的清除幅度減少約0.5 log10單位[49]。在本研究中，噬菌體Yen-yong1的劑量為4×107 PFU/cm2時(shí)，可分別將豬肉中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202減少1.77、0.67和1.43 log10單位(表2)。在107 PFU/cm2劑量水平下，Yen-yong1的有效性并不遜于Listex?P100，顯示出良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。后續(xù)研究計(jì)劃將其劑量提高至1×108 PFU/cm2、1×109 PFU/cm2或更高，以檢測(cè)其最佳抑菌劑量。
Yen-yong1在冷藏溫度(4℃)下的清除率高于室溫(25℃)(圖8)，這可能是因?yàn)樵谑覝?25℃)下，細(xì)菌的生理活動(dòng)相對(duì)活躍，細(xì)胞膜流動(dòng)性較好，細(xì)胞內(nèi)酶活性較高，能夠進(jìn)行正常的代謝和防御活動(dòng)，從而可能有更多的防御機(jī)制來(lái)抵抗噬菌體的感染，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，為模擬豬肉在常溫短時(shí)擺放出售和長(zhǎng)時(shí)間冷藏運(yùn)輸、儲(chǔ)存的實(shí)際情況，本研究在25℃下設(shè)定噬菌體的作用時(shí)間為3 h，而在4℃下則為24 h。噬菌體作用時(shí)間的延長(zhǎng)也可能是冷藏溫度下細(xì)菌清除率高于室溫的原因之一。
噬菌體溶菌酶、裂解酶、穿孔素等溶菌相關(guān)蛋白的編碼基因是對(duì)抗細(xì)菌的重要資源，其編碼產(chǎn)物也被廣泛認(rèn)為是抗生素的理想替代品。Yen-yong1的基因組中有5個(gè)基因分別編碼具有溶菌活性的穿孔素、裂解酶、溶菌酶和spanin，這些基因是潛在的可開(kāi)發(fā)資源。此外，噬菌體編碼的尾絲蛋白能特異性識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)菌表面的受體[50]，可作為細(xì)菌生物識(shí)別元件應(yīng)用于病原菌的快速檢測(cè)[51]。Yen-yong1基因組中還有許多功能未知的基因編碼假設(shè)蛋白，它們也可能具有重要的功能和開(kāi)發(fā)價(jià)值，如前文提到的解聚酶基因。為挖掘基因資源、揭示噬菌體與宿主細(xì)菌的關(guān)系，后續(xù)我們將陸續(xù)對(duì)這些未注釋的基因進(jìn)行表達(dá)與應(yīng)用開(kāi)發(fā)。
綜上所述，本研究分離培養(yǎng)的Yen-yong1揭示了新的病毒進(jìn)化譜系和豐富的基因資源；Yen-yong1可專性裂解多株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，且理化耐受性強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景。
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