材料與方法
細菌菌株、質(zhì)粒和生長條件。本研究中使用的細菌菌株和質(zhì)粒列于表1。
| 菌株或質(zhì)粒 | 基因型或描述 | 來源或參考文獻 |
|---|---|---|
| 菌株 | ||
| S. maltophilia ATCC 13637 | 野生型菌株 | CGMCC |
| E.coli DH5α | 用于分子克隆的宿主菌株 | 實驗室收藏 |
| E. coli BL21(DE3) | 用于蛋白質(zhì)表達的宿主菌株 | 實驗室收藏 |
| SM004-SM055 (共51個菌株) | D0107-04627 (共51個菌株)，通過pK18mob載體整合構(gòu)建的嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637組氨酸激酶基因插入突變體； Kanr | 本研究 |
| SM056 | IFD-bfmA, bfmA (Smlt4209) 框內(nèi)缺失突變體 | 本研究 |
| SM057 | IFD-bfmK, bfmK (Smlt4208) 框內(nèi)缺失突變體 | 本研究 |
| SM058 | IFD-bfmA-bfmA, IFD-bfmA的互補菌株，含有pBBRMCS2:::bfmA載體； Kanr | 本研究 |
| SM059 | IFD-bfmK-bfmK, IFD-bfmK的互補菌株，含有pBBRMCS2:::bfmK載體； Kanr | 本研究 |
| SM060 | IFD-bfmA-bfmA*, 類似于SM059，但在bfmA的3'端帶有His6編碼序列，用于ChIP分析； Kanr | 本研究 |
| SM061 | IFD-acoT, acoT (Smlt0800) 框內(nèi)缺失突變體 | 本研究 |
| SM062 | IFD-acoT-acoT, IFD-acoT的互補菌株，含有pBBRMCS2::acoT載體； Kanr | 本研究 |
| SM063 | IFD-bfmA-acoT, 含有pBBRMCS2::acoT載體的菌株IFD-bfmA，用于上位性分析； Kanr | 本研究 |
| 質(zhì)粒 | ||
| pK18mob | 通過單交換創(chuàng)建突變體的自殺載體； Kanr | Schafer et al. (40) |
| pK18mobsacB | 通過雙交換創(chuàng)建突變體的自殺載體； Kanr | Schafer et al. (40) |
| pET30a | 蛋白質(zhì)表達載體； Kanr | Novagen |
| pBBR1MCS2 | 用于遺傳互補的廣宿主范圍載體 | 實驗室收藏 |
| pBBR-4208 | pBBR1MCS2::Smlt4208, bfmK突變體的遺傳互補載體； Kanr | 本研究 |
| pBBR-4209 | pBBR1MCS2::Smlt4209, bfmA突變體的遺傳互補載體； Kanr | 本研究 |
| pBBR-0800 | pBBR1MCS2::Smlt0800, acoT突變體的遺傳互補載體； Kanr | 本研究 |
| pET30a-4209 | pET30a:Smlt4209, 用于BfmA表達； Kanr | 本研究 |
| pET28a-4208 | pET28a:::Smlt4208, 用于BfmK表達； Kanr | 本研究 |
分子克隆和細菌菌株的遺傳操作。使用自殺載體pK18mob和pK18mobsacB分別通過同源單交換方法和同源雙交換方法構(gòu)建嗜麥芽窄食單胞菌的插入失活突變體和框內(nèi)缺失突變體，如前所述。用于擴增相關(guān)DNA序列的引物列于表2。插入失活突變體在含有卡那霉素的NYG平板上篩選，框內(nèi)缺失突變體在含有10%蔗糖的NYG平板上篩選。為了構(gòu)建點突變，根據(jù)產(chǎn)品手冊使用Fast Mutagenesis System（Transgene,China）。常用的分子克隆方法，如PCR、連接和DNA限制性內(nèi)切酶消化，按照《分子克隆：實驗室手冊》中的說明進行。
表2：本研究中使用的引物| 引物 | 序列 (5'→3') | 用途 |
|---|---|---|
| IFD4208 | GAATTCTGCGGAAGCCCTGGTGCA | 構(gòu)建bfmK框內(nèi)缺失突變體 |
| GGATCCGAGCCAGTCACTGGCACTGC | ||
| GGATCCATCGCCGAGGGCGACCGA | ||
| AAGCTTGATCAGGGCATGGTGCTTGG | ||
| C4208 | AAGCTTATGCTGGCCCTGGCCAGC | 用于bfmK互補 |
| GAATTCTCAGGTGAACTTTCCCAGCAG | ||
| P4208 | CCATGGATCTGGCCCTGGCCAGCCTG | 用于BfmK表達 |
| AAGCTTGGTGAACTTTCCCAGCAGCAG | ||
| H237A | GCTGCAGTGGCGGCAGACCTGCGC | 構(gòu)建BfmK(H237A) |
| TGCCGCCACTGCAGCCAGCATATG | ||
| IFD4209 | GAATTCGGAGAAATCGGAACGCCAGC | 構(gòu)建bfmA框內(nèi)缺失突變體 |
| GGATCCCAGCAGCACGTCCAGCGC | ||
| GGATCCGGGCAGGCCTCACCCGGT | ||
| AAGCTTTGCCCTGTGGTGGCGCAT | ||
| C4209 | GGTACCATGACAACTCCCGCCCGT | 用于bfmA互補 |
| AAGCTTTCACAGCACCTGTACCTCGGC | ||
| P4209 | CATATGACAACTCCCGCCCGTGTC | 用于BfmA表達 |
| AAGCTTCAGCACCTGTACCTCGGCG | ||
| D55A | GACGTGATCATCATCCTCGCGTGGATGATG | 構(gòu)建BfmA(D55A) |
| CGCGAGGATGATCACGTCCGGGCGATC | ||
| His4209 | GGTACCATGACAACTCCCGCCCGT | 構(gòu)建用于ChIP分析的菌株 |
| AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGCAGCACCTGTACCTCGGC | ||
| PR4209 | CGGCAGGATGTGTTCGGGAG | 用于EMSA，PSmlt4209探針 |
| GCAGGCAGTATCAGGCAGG | ||
| IFD0800 | AAGCTTATGCGCAAGACGGGATGG | 構(gòu)建acoT框內(nèi)缺失突變體 |
| GGATCCGGTTTTCGACTGCTGCCT | ||
| GGATCCGCCTATCGCCAGCGCCTGG | ||
| GAATTCTCAGAGCAGCGGCCTGAG | ||
| C0800 | AAGCTTATGCGCAAGACGGGATGG | 用于acoT突變體互補 |
| GAATTCTCAGAGCAGCGGCCTGAG | ||
| P0800 | CGATGGCCACGCTGGTGCCT | 用于EMSA，PSmlt0800探針 |
| TGGAGTCTCCTCATCGACAG | ||
| Q0570 | GAAGTGGAGCTGGGCGAAAG | 用于RT-PCR，Smlt0570 |
| GGACGCATCGTCTGGATGTAC | ||
| Q0800 | AAAAGCCGACCGTGGTAGTGA | 用于RT-PCR，Smlt0800 |
| GTTGGGCGGCACGTCAAT | ||
| Q0978 | AACGCTGACCCGCGAAGT | 用于RT-PCR，Smlt0978 |
| TGGTCGTTGGCGAACACG | ||
| Q3568 | GAGCTGCCGGACAAGATTGC | 用于RT-PCR，Smlt3568 |
| ATCCAGCACCAGATCGCCCACC | ||
| Q3949 | ACCTGGGCAAACCATTCGA | 用于RT-PCR，Smlt3949 |
| TCCAGCAGCCGGTATTCG | ||
| Q4208 | GCGGGTCGGTGTACTGAAGG | 用于RT-PCR，bfmK |
| ATCGGCCAAGCGTCGTAG | ||
| Q4209 | ATGACGACTCCCGCCCGT | 用于RT-PCR，bfmA |
| CGACCTGCAGCAGCACGTC |
表型表征。觀察在NYG平板上培養(yǎng)24小時的細菌菌落形態(tài)。在豐富NYG培養(yǎng)基和有氧條件下的細菌生長通過自動化微生物生長曲線分析系統(tǒng)Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd.,USA）測量。對于細菌游動性測定，將菌株用牙簽接種到含有0.1%NYG的半固體瓊脂中，并在28°C培養(yǎng)12小時，測量游動區(qū)的直徑。對于生物膜定量，使用先前報道的結(jié)晶紫染色法。將嗜麥芽窄食單胞菌培養(yǎng)物定量接種到96孔聚苯乙烯板的NYG培養(yǎng)基中，板在28°C靜置培養(yǎng)5小時。同時，通過酶標儀（Tecan Infinite 200 Pro）在600納米波長下測量板中細菌生長的光密度值（OD???）。在染色前用水沖洗板中的孔，然后用結(jié)晶紫（1%）染色20分鐘，再沖洗。接著，用無水乙醇溶解結(jié)晶紫染色劑，并在酶標儀上測量590納米波長下的生物膜量（n=8）。
RT-PCR和實時定量PCR測定。使用TRIzol（Invitrogen,USA）提取細菌總RNA，并用NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher,USA）定量。接著，使用DNA-free DNase（Life Technologies）純化提取的RNA以去除任何污染的DNA。使用隨機引物（Promega,USA）和Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）（Invitrogen,USA）從純化的RNA合成cDNA。包括嗜麥芽窄食單胞菌DNA模板作為PCR的陽性對照，轉(zhuǎn)移信使RNA（tmRNA）擴增用作RT-PCR的加樣對照；在cDNA合成過程中缺少逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品作為陰性對照，以評估潛在的DNA污染。用于擴采樣基因的引物列于表2。
蛋白質(zhì)表達、純化和磷酸化測定。使用pET28a和pET30a（Novagen）表達載體分別在大腸桿菌BL21（DE3）細胞中表達重組BfmA-His?和BfmK-His?蛋白。用于構(gòu)建重組載體的PCR引物列于表2。BfmA-His?通過Ni-次氮基三乙酸（NTA）親和層析純化，根據(jù)制造商手冊（Novagen）。BfmK HK的反向膜囊泡根據(jù)我們先前研究中使用的方法制備。純化的蛋白質(zhì)和反向膜囊泡儲存在儲存緩沖液（50 mM Tris-HCl,0.5 mM EDTA,50 mM NaCl,5%甘油；pH 8.0）中。
我們按照先前使用的方法進行體外磷酸化測定。簡而言之，對于自動磷酸化測定，將BfmK反向膜囊泡在20微升體積的自動磷酸化緩沖液（50 mM Tris-HCl[pH 7.8],2 mM二硫蘇糖醇[DTT],25 mM NaCl,25 mM KCl,5 mM MgCl?）中與含有10微居里[γ-32P]ATP（PerkinElmer）的100微摩爾ATP在28°C孵育10分鐘。為了檢測BfmK和BfmA之間的磷酸轉(zhuǎn)移，將20微摩爾純化的可溶性BfmA加入反應(yīng)混合物中，然后在28°C孵育圖4中指定的時間。通過加入6X SDS-PAGE上樣緩沖液終止反應(yīng)。然后將磷酸化的蛋白質(zhì)在12%SDS-PAGE凝膠上分離。電泳后，將凝膠暴露于磷光成像屏1小時，并通過磷光成像系統(tǒng)（Amersham Biosciences）記錄凝膠的放射性信號。
ChIP。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）方案遵循先前的研究。簡而言之，將嗜麥芽窄食單胞菌在NYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD???為0.4。用1%甲醛交聯(lián)細胞，隨后用0.5 M甘氨酸淬滅5分鐘。通過離心收獲的細菌培養(yǎng)物（4毫升）用10毫升冰冷的Tris緩沖鹽水（TBS）緩沖液（20 mM Tris-HCl[pH 7.5],150 mM NaCl）洗滌兩次，然后重懸于1毫升裂解緩沖液（10 mM Tris[pH 8.0],20%蔗糖,50 mM NaCl,10 mM EDTA,10毫克/毫升溶菌酶）中。將IP緩沖液（50 mM HEPES-KOH[pH 7.5],150 mM NaCl,1 mM EDTA,1%Triton X-100,0.1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS,1 mM苯甲基磺酰氟）加入細菌細胞懸液中，并使用Diagenode Bioruptor UCD-300超聲破碎儀（Diagenode,USA）對細胞進行超聲處理，以產(chǎn)生平均約200 bp的DNA片段。離心后，用20微升蛋白A在4°C在慢速旋轉(zhuǎn)器上預(yù)清除溶液10分鐘，并保留100微升等分作為加樣對照DNA（輸入樣品）。對于ChIP測定，將20微升蛋白A-瓊脂糖珠（50%漿液）和2微升抗-His?抗體加入800微升等分中，并在4°C與慢速旋轉(zhuǎn)孵育過夜。第二天，通過離心收集珠子，并用IP緩沖液和洗滌緩沖液（10 mM Tris-HCl[pH 8.0],250 mM LiCl,1 mM EDTA,0.5%Nonidet P-40[相當于Triton X-114],0.5%脫氧膽酸鈉）洗滌。通過加入100微升洗脫緩沖液（50 mM Tris[pH 7.5],10 mM EDTA,1%SDS）從珠子上洗脫免疫沉淀的染色質(zhì)，并將溶液在65°C孵育10分鐘。加入RNase A以去除RNA污染。使用蛋白酶K進行交聯(lián)反轉(zhuǎn)。使用PCR純化試劑盒（Qiagen,USA）純化DNA。對于半定量PCR，使用1微升洗脫的DNA和1微升對照DNA作為模板，用適當?shù)囊镞M行PCR。捕獲的DNA量歸一化到對照輸入DNA。
EMSA。對于電泳遷移率變動分析（EMSA），使用表2中所示的引物通過PCR擴增bfmA和acoT操縱子的啟動子區(qū)域。使用T4多核苷酸激酶（New England Biolabs[NEB],USA）用[γ-32P]ATP對PCR產(chǎn)物進行末端標記。將BfmA蛋白（1微克）和探針（4飛摩爾）在反應(yīng)緩沖液[10 mM Tris(pH 7.0),50 mM KCl,1 mM DTT(pH 7.5),2.5%甘油,5微升MgCl?,50納克/微升poly(dI-dC),0.05%NP-40,和10 mM EDTA]中孵育20分鐘。加入DNA上樣緩沖液（0.25%溴酚藍,40%蔗糖）終止反應(yīng)，樣品通過8%非變性PAGE分離。使用磷光成像屏檢測放射性信號。不同濃度的未標記DNA探針用作競爭者。
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