摘要:試驗(yàn)旨在篩選優(yōu)質(zhì)土壤源益生菌菌種資源，為畜牧生產(chǎn)中微生態(tài)制劑研發(fā)提供候選菌株。試驗(yàn)以北京市郊區(qū)農(nóng)田土壤為材料，經(jīng)紫外誘變、革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)分離并篩選出1株對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯抑制能力的菌株。通過16S rRNA基因進(jìn)化分析和種屬鑒定，判定該菌為一株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。進(jìn)一步通過耐熱、耐酸、耐膽鹽和抗生素敏感性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該地衣芽孢桿菌在85℃處理10 min后存活率高達(dá)93.33%，pH為3.0及2.5時(shí)對(duì)其活性均影響較小，并且在0.3%、1.0%和2.0%的膽鹽濃度下培養(yǎng)3h仍可繼續(xù)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出優(yōu)良的抗逆性。通過與病原菌混合培養(yǎng)以及對(duì)多種致病菌的抑菌試驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用。
我國(guó)是豬的養(yǎng)殖和消費(fèi)大國(guó)，豬肉是人民肉類膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部數(shù)據(jù)顯示，在經(jīng)歷了非洲豬瘟及新型冠狀病毒肺炎疫情的考驗(yàn)后，2020年全國(guó)生豬生產(chǎn)基本恢復(fù)，規(guī)?；蔬_(dá)到57%。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)?；s化水平不斷提升，動(dòng)物與自然環(huán)境(土壤等)的接觸受到極大限制，導(dǎo)致動(dòng)物正常消化道微生物區(qū)系建立發(fā)生障礙。特別是在仔豬斷奶階段，在外界環(huán)境條件發(fā)生變化時(shí)，易引起動(dòng)物消化道微生態(tài)失衡，從而降低了仔豬對(duì)病原菌的抵抗能力，引起動(dòng)物機(jī)體細(xì)菌性腹瀉，影響生產(chǎn)性能。長(zhǎng)期以來，抗生素在改善畜禽生長(zhǎng)性能和疾病防治方面發(fā)揮重要作用，但養(yǎng)殖業(yè)濫用抗生素現(xiàn)象十分普遍，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、耐藥菌株擴(kuò)散和抗生素殘留等一系列問題，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和人類健康。因此，開發(fā)新型抗生素替代品已是當(dāng)前飼料添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
芽孢桿菌有廣譜抑菌活性，能產(chǎn)生豐富的代謝活性物質(zhì)，具有良好的益生作用。耐高溫、耐酸，且方便保存，是當(dāng)前應(yīng)用廣泛的一種益生菌。地衣芽孢桿菌對(duì)病原微生物有抑制和拮抗作用，對(duì)體內(nèi)有益菌則有促生長(zhǎng)作用，能夠調(diào)整與治療菌群失調(diào)，還可通過奪氧生物效應(yīng)使腸道缺氧，利于大量有益健康的厭氧菌生長(zhǎng)，通過此種雙重作用可以維持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡，進(jìn)而預(yù)防和治療腸道疾病。由于不同菌株間具有特性差異，且其生長(zhǎng)特性、制備工藝、生物學(xué)活性以及在畜禽中的作用效果會(huì)因發(fā)酵原料及應(yīng)用對(duì)象不同而產(chǎn)生很大差異。目前雖已有較多芽孢桿菌制劑應(yīng)用于飼料中，但源于環(huán)境土壤的地衣芽孢桿菌益生菌菌株卻鮮見報(bào)道。因此，篩選出能明顯抑制常見致病菌且抗逆性強(qiáng)的芽孢桿菌具有較大的研究和開發(fā)前景。本研究以土壤為材料分離并篩選地衣芽孢桿菌，研究其生理生化特性和益生性能，為益生菌在畜禽中的應(yīng)用提供菌種。
1材料與方法
糖20g，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三氨2g，七水硫酸鎂0.2g，四水硫酸錳0.05g，酵母粉4g，用蒸餾水定容至1000mL。
MRS瓊脂培養(yǎng)基:1L MRS肉湯培養(yǎng)基中加瓊脂15 g。
麥康凱培養(yǎng)基:月示胨胨3g，豬膽鹽5g，中性紅0.025g，蛋白胨胨17g，乳糖10g，結(jié)晶紫0.001g，氯化鈉5g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1000mL。
M17培養(yǎng)基:大豆蛋白胨胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，酪蛋白胨胨5g，抗壞血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二鈉19g，MgSO4·7H2O0.25g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1000mL。
糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨胨5g，牛肉粉5g，酵母膏5g，吐溫80 0.5 mL，糖或醇類10g，瓊脂5g，蒸餾水1 000mL，加上1.6%溴甲酚紫溶液1.4mL。
乳糖測(cè)定培養(yǎng)基:乳糖10g，酵母膏1g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。
LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，用蒸餾水定容至1000mL。
LB固體培養(yǎng)基:1L LB培養(yǎng)基中加瓊脂15g。
1.2菌株的分離與純化
取1g土樣放于裝有9mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，漩渦器震蕩混勻。取稀釋液進(jìn)行10倍遞增稀釋，然后選擇3個(gè)適宜梯度的稀釋液各1 mL涂布于含有10mg/kg放線菌酮的MRS瓊脂培養(yǎng)基及M17瓊脂培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48~72h，觀察并記錄菌落形態(tài)。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的特征單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行劃線分離純化。觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4℃冰箱貯藏備用。
將長(zhǎng)勢(shì)良好的特征單菌進(jìn)行紫外誘變，涂布于LB平板上，每平皿控制菌落在30~50個(gè)，在37℃下恒溫培養(yǎng)。在剛產(chǎn)生針尖樣菌落時(shí)，用內(nèi)徑6mm的打孔器連同下方瓊脂一同取出，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌空白平皿內(nèi)。在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，涂布于有金黃色葡萄球菌的平皿上，篩選出抑制能力強(qiáng)的誘變菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
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