1.4噬菌體生物學(xué)特性研究
1.4.1噬菌體裂解譜測(cè)定
將表2所述待測(cè)菌株提前復(fù)蘇并在搖床中37℃、200 r/min孵育6h至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，將100μL對(duì)應(yīng)菌株的菌液與高壓冷卻至40℃左右的900μL LB半固體培養(yǎng)基混合均勻后倒入LB固體培養(yǎng)基上，靜置等待其晾干。用移液器槍頭吸取5μL噬菌體液滴加在培養(yǎng)基表面，重復(fù)三次，并在同一平板上滴加等量生理鹽水作為空白對(duì)照，待培養(yǎng)基表面干燥后將培養(yǎng)基倒置放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日取出觀察有無噬菌斑。
表2噬菌體宿主譜
1.4.2最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定
提前過夜復(fù)蘇宿主菌雞白痢沙門菌C79-13至對(duì)數(shù)期，涂布平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)量后調(diào)整至1.0×107 CFU/mL，按照感染復(fù)數(shù)(MOI)(每毫升噬菌體數(shù)量/每毫升宿主菌數(shù)量)為10、1、0.1、0.01、0.001在離心管中分別加入100μL噬菌體上清液和100μL菌液，并在各離心管中加入LB液體培養(yǎng)基至2 mL使各個(gè)體系的總體積保持相同，振蕩混勻后置于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)6 h，后取出10 000×g離心15 min，取上清液，通過雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，計(jì)算得最高噬菌體效價(jià)對(duì)應(yīng)的MOI即為本株噬菌體對(duì)應(yīng)的最佳MOI。
1.4.3一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定
取5 mL 1.0×107 CFU/mL宿主菌菌液于15 mL離心管中，根據(jù)1.4.2中測(cè)得的最佳MOI比例加入相應(yīng)體積的噬菌體液，并加入滅菌LB液體培養(yǎng)基保持反應(yīng)體系為10 mL，振蕩混勻后在37℃、200 r/min搖床孵育2 h。在2 h培養(yǎng)過程中，每間隔10 min取出0.5 mL培養(yǎng)物，10 000×g離心10 min后棄去沉淀并將上清液過0.22μm濾器，用雙層平板法測(cè)定、用GraphPad Prism8.0軟件繪制一步生長(zhǎng)曲線，同時(shí)根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出噬菌體的潛伏期、爆發(fā)期和裂解量。裂解量為爆發(fā)末期噬菌體效價(jià)與感染初期宿主菌濃度的比值。
1.4.4噬菌體紫外線敏感性測(cè)定
取10 mL噬菌體液于空培養(yǎng)皿中，在距離紫外線30 cm處照射，分別間隔5 min從中取樣1 mL，并用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，重復(fù)三次。
1.4.5噬菌體酸堿度耐受程度測(cè)定
配制pH范圍為2.0~13.0的LB液體培養(yǎng)基，并在各管中加入效價(jià)為1.0×108 PFU/mL的噬菌體液，用移液器槍頭吹打混勻，在37℃靜置1 h后取出用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，重復(fù)三次。
1.4.6噬菌體溫度敏感性測(cè)定
各取500μL噬菌體液于1.5 mL離心管中，準(zhǔn)備同樣的7管，置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴，各管分別在30 min、60 min、90 min后取樣，每次取100μL用雙層瓊脂平板法測(cè)定樣本中噬菌體效價(jià)，重復(fù)三次。
1.5噬菌體全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析
1.5.1噬菌體全基因組測(cè)序
用天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取沙門菌噬菌體PC79-13的基因組，按照試劑盒指示操作，提取后樣品委托蘇州金唯智生物公司進(jìn)行二代Illumina測(cè)序。獲得原始數(shù)據(jù)后，先用Fastp對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)化過濾和質(zhì)控，將數(shù)據(jù)預(yù)處理，最后將質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)用Spades進(jìn)行組裝，得到完整序列。
1.5.2噬菌體生物信息學(xué)分析
基于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與本實(shí)驗(yàn)分離得到的沙門菌噬菌體基因組相似的其他噬菌體基因組，并用CGView軟件繪制噬菌體全基因組圈圖。通過毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)和抗生素耐藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)篩選假定的毒力因子和抗生素耐藥性基因等?；诎ū緦?shí)驗(yàn)分離出的噬菌體在內(nèi)的20個(gè)噬菌體的主要衣殼蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，用Mega X軟件對(duì)噬菌體進(jìn)行進(jìn)化分析。用OAT軟件進(jìn)行基因組熱圖繪制，對(duì)分離純化出的噬菌體提取基因組并對(duì)基因組測(cè)序，經(jīng)BLAST序列比對(duì)分析噬菌體基因組已知的基因功能蛋白，確定噬菌體基因?qū)傩?，從基因水平上解析噬菌體。
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