1.2.2菌株的初步鑒定
1.2.2.1形態(tài)學(xué)觀察
將菌株接種到固體培養(yǎng)基上，放置在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，肉眼觀察菌落的形狀、大小、隆起度、邊緣透明度與顏色等培養(yǎng)特征。在普通光學(xué)顯微鏡下難以看清細(xì)菌的形狀和結(jié)構(gòu)，因此，需要通過革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色等方法，將菌體染上顏色，從而借助顏色的反差作用觀察菌體形態(tài)。經(jīng)染色后利用光學(xué)顯微鏡觀察革蘭氏染色、形狀、莢膜、芽孢以及鞭毛等菌體形態(tài)。
1.2.2.2生理生化鑒定
主要選擇了糖或醇類發(fā)酵試驗(葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖)、溫度生長范圍、pH生長范圍、需氧性試驗、硝酸鹽還原、吲哚試驗、硫化氫產(chǎn)生、明膠水解、酪素水解、淀粉水解、酪氨酸水解、耐鹽性試驗、過氧化氫酶的測定、卵磷脂酶的測定、甲基紅試驗、V-P試驗、石蕊牛奶反應(yīng)、溶菌酶抗性試驗以及在pH 5.7的營養(yǎng)肉湯上的生長等19項試驗進(jìn)行檢測，具體試驗方法參照《微生物學(xué)實驗手冊》和《微生物學(xué)實驗技術(shù)》。
1.2.3細(xì)菌16S rDNA鑒定
將細(xì)菌16S rDNA鑒定的通用引物作為上下游引物，以提取的菌株總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 13.7μL，10×Ex Taq buffer 2.0μL，5u Ex Taq 0.2μL，2.5mM dNTP Mix 1.6μL，上游引物(5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′)1μL，下游引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)1μL，DNA模板0.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，該步驟循環(huán)25次，最后72℃延伸10 min，于4℃冰箱保存。在進(jìn)行DNA測序之前，檢測PCR是否擴(kuò)增成功。取2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，用凝膠成像儀檢測。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。利用BLAST軟件，將測得的序列與GenBank中已知序列進(jìn)行比對，通過MEGA6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.2.4生長曲線的測定
細(xì)菌的生長要經(jīng)過遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期四個階段。在對數(shù)生長期，細(xì)菌生長速率最快，對碳源的利用率也最高。因此，測定菌株的生長曲線，將對數(shù)生長期內(nèi)的菌種制備成種子液，用于苯酚降解實驗。挑取兩個單菌落接種到富集培養(yǎng)基中，32℃、180 r/min放入全自動微生物生長曲線分析儀振蕩培養(yǎng)30 h。以未接種的富集培養(yǎng)基做空白對照，在600 nm波長下，每四小時測定OD值，以檢測細(xì)菌濃度。為減少誤差，取兩組平行實驗的平均值繪制生長曲線。
1.2.5菌株的降酚特性
將平板上的單個菌落接種到富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制成菌懸液。篩選菌株Y_1時，發(fā)現(xiàn)該菌在苯酚濃度1 100 mg/L時能良好生長。因此，將菌株在苯酚濃度1 100 mg/L、pH 7.0～7.2、接種量4%、溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，以不含苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白對照，采用4-氨基安替吡啉直接分光光度法[34]測定苯酚濃度。在相同條件下進(jìn)行三組平行試驗，取三組讀數(shù)的平均值。依據(jù)苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出苯酚的降解率。
苯酚降解率計算公式：苯酚降解率=(接種前的苯酚濃度-生長消耗剩余的苯酚濃度)/接種前的苯酚濃度×100%
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