噬菌體是一類感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，廣泛存在于自然界中。由于噬菌體具有數(shù)量多，體積小，繁殖快和基因組的高度可塑性等特點(diǎn)，使得工業(yè)發(fā)酵過(guò)程極易受到噬菌體的感染。噬菌體感染具有普遍性和頑固性，發(fā)酵企業(yè)一旦受到其感染，損失是不可估量的，并且至今仍無(wú)應(yīng)對(duì)良策。
大腸埃希氏菌BL21(DE3)是pET系統(tǒng)的常用表達(dá)宿主菌，pET系統(tǒng)使用T7啟動(dòng)子，是有史以來(lái)在大腸桿菌中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)，現(xiàn)已作為商品化產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用。BL21(DE3)在工廠和實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常受到噬菌體感染，因此防治噬菌體感染問(wèn)題亟需解決。
在細(xì)菌和噬菌體的共同進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)菌在感染過(guò)程中通常攜帶著廣泛的防御系統(tǒng)來(lái)防止噬菌體裂解。其中，比較典型且目前常用于基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)于2011年在化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)，是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌免受噬菌體或質(zhì)粒等外來(lái)遺傳元素的影響。目前人為防治噬菌體感染的常見措施主要包括用各種消毒劑殺滅噬菌體控制感染源、菌株輪換、自然突變篩選抗噬菌體菌株等。其中通過(guò)的傳統(tǒng)的基因工程策略以及基于細(xì)菌防御系統(tǒng)的噬菌體防治策略方法由于其操作簡(jiǎn)單，效果顯著而被廣泛使用。但是目前各個(gè)工廠或者實(shí)驗(yàn)室使用的抗噬菌體菌株大多只能抵御某一株或幾株特定噬菌體的感染，能夠抵御未有噬菌體感染的工程菌株依然值得挖掘。
本文對(duì)抗噬菌體菌株大腸埃希氏菌BL21-C和BL21-T進(jìn)行抗噬菌體能力和生長(zhǎng)曲線測(cè)定，結(jié)果表明通過(guò)導(dǎo)入以CRIPSR/Cas9系統(tǒng)為抵御系統(tǒng)的元件pPTCS可賦予BL21-C和BL21-T菌株抵御可以裂解BL21(DE3)的短尾類噬菌體侵染的能力，同時(shí)也穩(wěn)定維持著親本株的生長(zhǎng)情況，說(shuō)明抵御元件pPTCS的轉(zhuǎn)入并不會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)。
圖1為親本株BL21(DE3)和抗噬菌體菌株BL21-C、BL21-T感染噬菌體TR1(感染復(fù)數(shù)為1)的生長(zhǎng)曲線圖。其中，抗噬菌株BL21-C和BL21-T分別測(cè)試了在噬菌體TR1感染下有阿拉伯糖誘導(dǎo)和無(wú)阿拉伯糖誘導(dǎo)的生長(zhǎng)情況。無(wú)噬菌體感染設(shè)置為對(duì)照組。
抗噬菌體菌株BL21-C和BL21-T的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
為測(cè)定BL21-C和BL21-T的生長(zhǎng)穩(wěn)定性，設(shè)置三組實(shí)驗(yàn)：誘導(dǎo)組(噬菌體TR1以感染復(fù)數(shù)為1侵染且加入終濃度為0.02g/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)抵御元件工作)、不誘導(dǎo)組(噬菌體TR1以感染復(fù)數(shù)為1侵染但無(wú)阿拉伯糖誘導(dǎo))和對(duì)照組(無(wú)噬菌體侵染)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組重復(fù)。
將BL21(DE3)、BL21-C和BL21-T三株菌株的單克隆分別接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，其中BL21-C和BL21-T所在培養(yǎng)基中額外加入終濃度為20μg/mL的慶大霉素，誘導(dǎo)組加入終濃度為0.02g/L的阿拉伯糖，在37℃，220rpm的條件下培養(yǎng)至OD600值為0.1后加入噬菌體TR1，該時(shí)刻記為0h，隨后每隔1h直至8h取樣200μL測(cè)量OD600值并記錄。
結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，誘導(dǎo)組與對(duì)照組的BL21-C和BL21-T生長(zhǎng)情況與BL21(DE3)的生長(zhǎng)情況基本一致，都呈上升狀態(tài)。而未誘導(dǎo)組由于未誘導(dǎo)抵御元件工作，沒有賦予細(xì)菌抵御噬菌體的能力，從而導(dǎo)致其受噬菌體的侵染，OD600值的下降。該結(jié)果說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)入以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為抵御系統(tǒng)的元件，賦予BL21-C和BL21-T菌株抵御噬菌體侵染能力的同時(shí)，也穩(wěn)定維持著原本的生長(zhǎng)情況，抵御元件的轉(zhuǎn)入不會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)。
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