摘要
目的：通過(guò)異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記分離得到的雞白痢沙門菌噬菌體PC79-13，建立熒光噬菌體檢測(cè)雞白痢沙門菌的流程。方法：從污水中分離得到一株雞白痢沙門菌(Salmonella pullorum)的烈性噬菌體，透射電鏡表征其形貌，液體培養(yǎng)宿主后感染測(cè)定噬菌體一步生長(zhǎng)曲線、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性及最佳感染復(fù)數(shù)，以及利用生物信息學(xué)方法分析其基因組，了解其生物學(xué)特性和基因特征。最后用FITC標(biāo)記此噬菌體獲得一種熒光噬菌體探針。結(jié)果：此株雞白痢沙門菌噬菌體(命名為PC79-13)可在雞白痢沙門菌C79-13雙層瓊脂平板上形成大小均一、清晰而透亮的噬菌斑。電鏡觀察顯示:噬菌體PC79-13頭部為直徑約60 nm的正二十面體，長(zhǎng)尾，屬于有尾噬菌體屬長(zhǎng)尾噬菌體科。以雞白痢沙門菌C79-13為宿主菌測(cè)得該噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)為0.01，一步生長(zhǎng)曲線顯示噬菌體PC79-13的潛伏期為30 min，爆發(fā)期為80 min。此外，噬菌體PC79-13對(duì)酸堿環(huán)境皆有較大耐受性，pH=7.0為其最適酸堿度。其抗紫外線照射和高溫能力也較強(qiáng)。FITC標(biāo)記的熒光PC79-13，宿主雞白痢沙門菌C79-13感染滴度有少量損失(小于10%)。熒光標(biāo)記的噬菌體PC79-13能高效結(jié)合雞白痢沙門菌C79-13及其他3株雞白痢沙門菌，在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光棒狀結(jié)構(gòu)。熒光PC79-13不結(jié)合實(shí)驗(yàn)室保存的4株鼠傷寒沙門菌、4株腸炎沙門菌及52株大腸桿菌菌株。結(jié)論：分離到一株特異性裂解雞白痢沙門菌的噬菌體PC79-13。熒光標(biāo)記的PC79-13仍然保持特異性吸附實(shí)驗(yàn)室保存的4株雞白痢沙門菌菌株的能力，在暗場(chǎng)顯微鏡下可見(jiàn)目標(biāo)沙門菌呈現(xiàn)亮綠色熒光，檢測(cè)限為10 CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間少于20 min。因此，構(gòu)建的熒光噬菌體快速檢測(cè)法，有潛力未來(lái)應(yīng)用于臨床常見(jiàn)雞白痢沙門菌快檢。
雞沙門菌病以高發(fā)病率和高死亡率著稱，對(duì)2周齡以內(nèi)雛雞構(gòu)成嚴(yán)重威脅，而成年雞感染多呈現(xiàn)為慢性或隱性帶毒狀態(tài)，且所有種類的雞均易感。這種廣泛的易感性導(dǎo)致沙門菌對(duì)我國(guó)畜禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重威脅食品安全。為了保障食品安全，我國(guó)參照多個(gè)國(guó)際組織和地區(qū)即食食品中沙門菌的限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有11類食品設(shè)定了嚴(yán)格的沙門菌限量規(guī)定，即在檢測(cè)的5份食品樣品中，不得有任何一份樣品檢測(cè)出沙門菌。為有效防控沙門菌的傳播，需要對(duì)其進(jìn)行精確檢測(cè)。然而，現(xiàn)有的檢測(cè)方法，如傳統(tǒng)檢測(cè)、免疫分析檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等，不僅檢測(cè)周期長(zhǎng)，而且耗費(fèi)大量人力物力，這使得其在實(shí)際操作中難以被廣泛應(yīng)用。因此，急需研發(fā)更加高效、便捷的沙門菌檢測(cè)方法，以應(yīng)對(duì)畜禽業(yè)和食品安全領(lǐng)域的挑戰(zhàn)。
噬菌體是一種專門以細(xì)菌為宿主的病毒，在1916年經(jīng)d’Hérelle首次分離，因其能特異性侵染宿主菌并大量復(fù)制增殖，正逐漸成為解決細(xì)菌耐藥性的新策略。此外，噬菌體通過(guò)宿主細(xì)菌擴(kuò)增，可低成本獲得數(shù)量巨大的噬菌體。通過(guò)熒光染料標(biāo)記的噬菌體，仍然能保持特異性吸附宿主菌的能力，因此可在熒光顯微鏡下迅速觀察到由于數(shù)量眾多的熒光噬菌體吸附于宿主菌后呈現(xiàn)的明亮熒光棒狀結(jié)構(gòu)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不足20 min，從而實(shí)現(xiàn)快速、低成本檢測(cè)沙門菌。
盡管目前已有一些新型檢測(cè)方法也被研發(fā)應(yīng)用，如基于重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)及表面生物傳感器檢測(cè)沙門菌的方法，但它們?nèi)源嬖谝欢ň窒扌?，如耗費(fèi)人力物力大等。相比之下，噬菌體作為生物材料，具有價(jià)格低廉、量大、制備簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)，尤其是其特異性侵染宿主菌的特性，使其成為優(yōu)秀的檢測(cè)原料。
異硫氰酸熒光素(FITC)是一種被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域的化學(xué)標(biāo)記物，在結(jié)構(gòu)上具有異硫氰基(-N=C=S)，異硫氰基與被標(biāo)記物蛋白質(zhì)的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵，形成穩(wěn)定的FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的熒光標(biāo)記。FITC最大發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm，最大吸收波長(zhǎng)為488 nm，處于堿性環(huán)境中具有明亮的黃綠色熒光，在酸性環(huán)境產(chǎn)生沉淀析出，熒光消失。FITC具有性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒、成本低、發(fā)光明亮易于觀察等特點(diǎn)，適合作為探針?lè)肿印?
本研究以雞白痢沙門菌C79-13為宿主菌，成功分離到一株裂解性強(qiáng)、宿主特異性強(qiáng)的沙門菌噬菌體，通過(guò)對(duì)噬菌體的生物學(xué)特性和基因組進(jìn)行系統(tǒng)研究，利用FITC染料標(biāo)記噬菌體，成功制備噬菌體熒光探針檢測(cè)沙門菌，為噬菌體用于實(shí)際檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。
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