摘要
本研究旨在從健康北極狐腸道中分離和鑒定具有益生菌潛能的乳酸菌，并對其體外益生功能進行評價。對分離菌株進行生理生化和16S rRNA鑒定，測定其生長曲線、產酸和耐酸曲線，測定該菌的膽鹽耐受性以及在人工胃液和人工腸液中的存活率，分別采用牛津杯瓊脂擴散法和紙片擴散法檢測該菌的抗菌活性和抗生素敏感性。最后選取20只雌性昆明小鼠，隨機分為2組(每組10只)，對照組灌胃生理鹽水，試驗組灌胃唾液乳桿菌(1×109 CFU/mL)，試驗期7 d。結果表明:結合16S rRNA和生理生化鑒定結果將其命名為唾液乳桿菌ZJBF005，該菌在MRS培養(yǎng)基中生長迅速，具有較強的產酸能力;在pH 4~7培養(yǎng)液之間生長良好，培養(yǎng)液pH低于2生長受到抑制;在人工胃液、人工腸液中培養(yǎng)3 h后的存活率分別為40.96%和86.70%;可在0.2%的膽鹽環(huán)境中生長;可抑制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長;對四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、磷霉素、阿奇霉素、甲氧芐啶和甲硝唑等抗生素不敏感;灌胃后的小鼠體重變化正常、無死亡、剖檢無病理性變化。綜上所述，來自健康北極狐腸道的唾液乳桿菌ZJBF005具有良好的益生菌特性，可作為益生菌的備選菌株。
益生菌是一種活的微生物，當給予足夠的劑量時，會對宿主的健康產生良好的影響。在人類中用于預防和治療疾病、傳染性和非傳染性疾病，并在家禽、家畜、水產養(yǎng)殖中有廣泛的應用。對于性能良好的益生菌來說，其在口腔溶菌酶、胃pH和腸膽汁等酸性環(huán)境中的生存能力是一個重要因素。益生菌的抑菌活性、抗炎活性和增強上皮細胞免疫屏障功能也是優(yōu)異益生菌所要具備的關鍵因素。
北極狐為犬科動物，目前對其腸道微生物的研究較少。前期研究表明，北極狐腸道存在復雜的微生物區(qū)系，在北極狐營養(yǎng)物質消化利用、維護機體健康和免疫功能方面發(fā)揮重要作用。本項目組已在健康北極狐腸道中分離獲得多種益生性能良好的益生菌。來自特定宿主的益生菌能更好地適應該宿主的環(huán)境。因此，本試驗旨在從健康北極狐腸道中分離和鑒定具有益生菌潛能的乳酸菌，并對其體外益生功能進行評價，為其在動物營養(yǎng)與飼料中應用提供理論基礎。
1、材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1樣品采集
2021年11月20日于長白山野生生物資源重點野外科學觀測試驗站采集24只冬毛期健康北極狐的腸道內容物。
1.1.2菌株和細胞
唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)ZJBF 005、大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 25922、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 14028和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均由中國農業(yè)科學院特產研究所特種動物營養(yǎng)與飼養(yǎng)團隊分離、鑒定和保存。
1.1.3試驗動物
21日齡無特定病原體(SPF)級雌性昆明小鼠20只，體重(22±2)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，動物生產許可證號:SCXK(遼)2020-0001。
1.2試驗方法
1.2.1菌株的分離培養(yǎng)
采集北極狐空腸腸段內容物1 mL裝于5 mL離心管，低溫條件下運輸回實驗室。將離心管置于生物安全柜內操作，離心管內加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)進行振蕩混勻，吸取100μL混合液進行梯度稀釋，隨即取10-5、10-6、10-7稀釋液100μL分別涂于MRS平板，置于恒溫培養(yǎng)箱。挑取單菌落在MRS平板中反復平板劃線以獲得純化菌株，篩選和保存革蘭氏陽性菌株，對純化后的菌株進行凍干保存。
1.2.2菌落形態(tài)及染色
取凍干菌粉于MRS液體試管中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后傳代，蘸取少量菌液采用平板劃線法培養(yǎng)單菌落，觀察菌落顏色和形態(tài)，采用革蘭氏染色法進行染色后，顯微鏡觀察。
1.2.3 16S rRNA基因序列測定
將待測菌株培養(yǎng)24 h后提取該細菌基因組DNA。以細菌基因組DNA作為目的基因進行PCR擴增。PCR反應體系見表1。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌株的保守序列約為1 500 bp，將片段長度正確的PCR產物送至天一輝遠生物科技有限公司進行測序。從GenBank中獲取的基因序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對，通過MEGA進行比對建樹。
表1 PCR反應體系