陰溝腸桿菌是一種人獸共患病病原菌，其傳播途徑廣泛，在高鹽環(huán)境下仍可大量繁殖。據(jù)報(bào)道，鯔魚(yú)、淡水鯊魚(yú)、克氏原螯蝦及羅氏沼蝦等水產(chǎn)動(dòng)物在感染陰溝腸桿菌后會(huì)出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象。此外，陰溝腸桿菌還可導(dǎo)致10日齡雛雞、牛及綿羊大規(guī)模死亡，對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)造成經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成重大威脅。如今，隨著抗生素在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，陰溝腸桿菌逐漸適應(yīng)并對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出抵抗性。陰溝腸桿菌編碼多種β-內(nèi)酰胺酶，如頭孢菌素酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及碳青霉烯酶等，故其對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥。目前陰溝腸桿菌對(duì)第一、二代頭孢類(lèi)及青霉素類(lèi)等藥物的耐藥率已高達(dá)90%以上，對(duì)第三、四代頭孢耐藥率呈逐年增加趨勢(shì)。此外，該菌還可與路德維希腸桿菌(Enterobacter ludwigii)、神戶(hù)腸桿菌(Enterobacter kobei)、霍馬切腸桿菌(Enterobacter hormaechei)等組合成陰溝腸桿菌復(fù)合體(Enterobacter cloacae complex)，陰溝腸桿菌復(fù)合體通常與多重耐藥(MDR)表型相關(guān)，這主要是由于它們對(duì)醫(yī)院環(huán)境適應(yīng)以及它們?nèi)菀撰@得許多含有抗性和毒力基因的遺傳移動(dòng)元件的能力。這種耐藥性限制了可供選擇的治療方案，增加了治療失敗和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)臨床治療構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。因此，急需針對(duì)陰溝腸桿菌開(kāi)發(fā)新型抗菌試劑。
裂解性陰溝腸桿菌噬菌體是天然存在的“殺菌劑”，具有高度特異性的感染和裂解能力，能在有效殺滅陰溝腸桿菌的同時(shí)大量增殖，因此噬菌體控制陰溝腸桿菌生長(zhǎng)具有天然性、安全性和特異性。據(jù)報(bào)道，噬菌體對(duì)細(xì)菌感染的治療已經(jīng)取得良好效果，但對(duì)多種不同細(xì)菌的混合感染，宿主譜較窄的噬菌體無(wú)法消滅所有種類(lèi)病原菌，治療效果并不理想。應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，噬菌體雞尾酒技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該方法將兩種或以上噬菌體制作成一種混合生物制劑，旨在通過(guò)協(xié)同作用拓寬抗菌譜，增強(qiáng)對(duì)多種細(xì)菌的殺菌能力并降低細(xì)菌對(duì)噬菌體的抗性。目前，噬菌體vB-Ecop-S523、噬菌體Ec53等裂解效果較好的陰溝腸桿菌噬菌體已被報(bào)道，這些噬菌體的裂解效果及穩(wěn)定性與噬菌體ZX14相似，但宿主譜較窄，僅可裂解特定陰溝腸桿菌，噬菌體ZX14具有較為廣泛的宿主譜，可裂解陰溝腸桿菌、神戶(hù)腸桿菌與路德維希腸桿菌。故有望將噬菌體ZX14與宿主譜互補(bǔ)、裂解效果和穩(wěn)定性相仿的噬菌體組合成噬菌體雞尾酒用于消滅陰溝腸桿菌復(fù)合體。隨著科研的不斷深入和技術(shù)進(jìn)步，噬菌體雞尾酒的適用范圍預(yù)計(jì)將進(jìn)一步擴(kuò)大，因此，提煉出新遺傳特征和生物學(xué)特性的噬菌體并構(gòu)建一個(gè)多樣化的噬菌體資源庫(kù)對(duì)噬菌體臨床治療應(yīng)用和發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。
本研究以從福建水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)污水中分離的陰溝腸桿菌菌株作為宿主，從揚(yáng)州某水產(chǎn)市場(chǎng)污水中分離一株高抗菌活性的裂解性噬菌體ZX14，對(duì)分離噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性及遺傳信息進(jìn)行了相關(guān)分析。這些研究為臨床治療陰溝腸桿菌感染提供了一種新治療策略，并為未來(lái)臨床實(shí)踐提供了新的可能性。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株儲(chǔ)存
陰溝腸桿菌2025從福建某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)水樣分離而來(lái)，將細(xì)菌在3%氯化鈉堿性蛋白胨水培養(yǎng)基(APW)中置于37℃、220 r/min培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)6 h，將所培養(yǎng)的菌液與50%甘油1∶1混合后置于-80℃保存。噬菌體ZX14由揚(yáng)州水產(chǎn)市場(chǎng)所分離，將噬菌體與25%甘油1∶1混合后置于-80℃保存。
1.1.2主要試劑與儀器
APW培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、氯化鈉30 g/L)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;氯仿、氫氧化鈉(片狀)、濃鹽酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;質(zhì)粒DNA小提試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司;PCR儀購(gòu)自杭州博日生物科技有限公司;抗菌藥物藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;離心管(50 mL)購(gòu)自無(wú)錫耐斯生命科技股份有限公司;移液器、超速離心機(jī)(Centrifuge 5810 R)購(gòu)自艾本德(中國(guó))有限公司;0.22μmol/L濾器購(gòu)自美國(guó)Milipore公司;無(wú)菌注射器購(gòu)自江蘇客樂(lè)醫(yī)用器械有限公司;微量分光光度計(jì)(Nano-300)購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司;渦旋混勻儀MX-S購(gòu)自美國(guó)SCILOGEX公司;90 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿購(gòu)自范德生物科技有限責(zé)任公司;水浴鍋購(gòu)自上海邦西儀器有限公司;病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生物科技有限公司。
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