本研究揭示了插入序列（IS）在原核生物基因組中的轉(zhuǎn)座如何導(dǎo)致CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的失活。CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物用來防御外來遺傳元素的主要機(jī)制，通過特定的導(dǎo)向RNA（crRNA）指導(dǎo)Cas蛋白識別并切割目標(biāo)序列。研究者通過篩選原核生物基因組序列，發(fā)現(xiàn)了多個自然發(fā)生的IS插入事件，這些事件破壞了CRISPR-Cas位點(diǎn)，尤其是IS1和IS10，它們顯示出對靶標(biāo)特異性的顯著放寬。本研究構(gòu)建了一個IS捕獲系統(tǒng)，監(jiān)測在雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)后IS插入到cas基因的事件，發(fā)現(xiàn)IS轉(zhuǎn)座在DNA修復(fù)機(jī)制存在的情況下仍然可以發(fā)生，并且IS轉(zhuǎn)座也檢測到其他宿主防御系統(tǒng)的插入。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了IS在抵消CRISPR-Cas活性、增加細(xì)菌對外國DNA入侵的易感性方面的潛力，這可能有助于細(xì)菌獲取有益的外源性移動遺傳元素（MGEs），增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性。研究還探討了IS在細(xì)菌適應(yīng)性中的角色，包括它們?nèi)绾瓮ㄟ^破壞CRISPR-Cas系統(tǒng)來促進(jìn)有益MGEs的獲取，以及這種機(jī)制如何影響細(xì)菌的進(jìn)化。通過異源表達(dá)特定類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，并構(gòu)建含有特定原間隔序列的質(zhì)粒，研究驗(yàn)證了IS插入對CRISPR-Cas系統(tǒng)的干擾作用。這項(xiàng)研究不僅增進(jìn)了對CRISPR-Cas系統(tǒng)和IS之間相互作用的理解，還對抗生素抗性傳播和細(xì)菌進(jìn)化的研究具有重要意義。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于測定不同TIR防御系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)對噬菌體感染的反應(yīng)。通過將單個轉(zhuǎn)化體在37°C下用適當(dāng)?shù)目股卦贚B培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后以1：100稀釋并接種到含有400μL LB肉湯和不同抗生素濃度的Bioscreen 100孔蜂窩板中。在37°C下每20分鐘監(jiān)測一次OD 600，持續(xù)25小時(shí)，并在Bioscreen C設(shè)備（Bioscreen C Labsystems）中連續(xù)搖動。通過測量細(xì)菌的吸光度（OD600），了解噬菌體感染對細(xì)菌生長的影響，以及TIR系統(tǒng)是否有效抑制了噬菌體的增殖。Bioscreen被用于快速篩選和鑒定那些能夠逃避TIR防御系統(tǒng)的噬菌體。通過連續(xù)監(jiān)測細(xì)菌培養(yǎng)的生長情況，研究人員可以識別出在TIR防御系統(tǒng)存在下仍能生長的噬菌體，這些噬菌體可能是通過突變獲得了逃避TIR系統(tǒng)的能力。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本研究強(qiáng)調(diào)了插入序列（IS）在細(xì)菌適應(yīng)性進(jìn)化中的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，IS元件能夠通過破壞CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，增加細(xì)菌對外國DNA的易感性，從而促進(jìn)有益外源基因的獲取。這種機(jī)制揭示了細(xì)菌在遺傳防御和外源基因獲取之間的進(jìn)化權(quán)衡關(guān)系。具體來說，IS元件，尤其是IS1和IS10，通過轉(zhuǎn)座至cas基因，顯著放寬了靶標(biāo)特異性，導(dǎo)致CRISPR-Cas系統(tǒng)的失活。即便在DNA修復(fù)機(jī)制存在的情況下，IS轉(zhuǎn)座至cas基因的活動仍然持續(xù)，并且這種轉(zhuǎn)座活動也影響到了其他宿主防御系統(tǒng)。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓寬了我們對CRISPR-Cas失活機(jī)制的理解，而且對于深入理解細(xì)菌遺傳多樣性、定殖、生存和進(jìn)化策略提供了新的視角。
圖1、IS元件向CRISPR-Cas基因座的天然轉(zhuǎn)座。顯示了在CRISPR-Cas基因座中發(fā)現(xiàn)的每個IS元件的代表性示例。箭頭代表CRISPR-Cas簇內(nèi)的IS（用星號標(biāo)記）和基因，箭頭方向表示IS插入或基因轉(zhuǎn)錄的方向。物種名稱下方的基因組坐標(biāo)表示每個cas簇的范圍，編號線表示每個基因或IS在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)的相對位置。
圖2、IS失活的CRISPR-Cas系統(tǒng)有助于快速獲取和提高含有可識別原始間隔區(qū)的抗生素抗性質(zhì)粒的持久性。a）E.amylovora 7-3的工程型I-E CRISPR-Cas基因座示意圖。將完整或IS10中止的CRISPR-Cas基因座分別克隆到質(zhì)粒pEraCas或pEraCas-IS10中，用于CRISPR-Cas干擾測定。b）E.amylovora 7-3型I-E CRISPR-CAS系統(tǒng)對大腸桿菌DH10B細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化干擾。通過計(jì)算每100 ng質(zhì)粒的集落形成單位（CFU）來確定轉(zhuǎn)化效率。數(shù)據(jù)顯示為來自三個生物學(xué)重復(fù)的±SD平均值;**P<0.01;ns不顯著，使用log10轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)的雙尾未配對t檢驗(yàn);P=0.0018,0.6150（從左到右）。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供。c）不同抗生素暴露下供試菌株的生長曲線。陰影區(qū)域表示3次生物學(xué)重復(fù)±S.D.的平均值。氨芐青霉素（Amp）用于維持宿主體內(nèi)的pEraCas或pEraCas-IS10，氯霉素（Chl）和壯觀霉素（Spe）用于維持p15A-Eraprotos-spe和p15A-spe。
圖3、IS介導(dǎo)了在選擇壓力下獲得質(zhì)粒的好處和遺傳denfense之間的適應(yīng)性權(quán)衡。a)在SYHY01和SYHY02中轉(zhuǎn)化和傳代期間的質(zhì)粒穩(wěn)定性。b)大腸桿菌DH10B中pEraCas和pEraCas-pBAD的cas操縱子內(nèi)8個基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。通過RT-qPCR定量基因表達(dá)并歸一化為內(nèi)源性16sRNA水平。c）通過計(jì)數(shù)每200 ng質(zhì)粒的CFU來確定pEraCas（靶向SYHY03染色體）、pEraCas-IS10（對照）和pEraCas-pBAD（在l-阿拉伯糖存在下靶向SYHY03染色體）向SYHY03的轉(zhuǎn)化效率。d）pEraCas-pBAD攜帶L-阿拉伯糖誘導(dǎo)型pBAD啟動子以驅(qū)動cas操縱子表達(dá)的示意圖。引物對P1和P2旨在擴(kuò)增pEraCas-pBAD的整個cas操縱子;顯示了預(yù)期的擴(kuò)增子大小。e使用引物對P1和P2對IS插入pEraCas-pBAD cas操縱子進(jìn)行菌落PCR篩選。泳道“WT”，用pEraCas-pBAD模板對照擴(kuò)增子;較大的PCR產(chǎn)物（泳道C5、D1和D6）提示IS轉(zhuǎn)座事件。f）通過Sanger測序確認(rèn)IS插入突變體C5、D1和D6的cas操縱子中。
圖4、僅誘導(dǎo)Cas蛋白表達(dá)不會導(dǎo)致宿主菌株出現(xiàn)明顯的生長缺陷。在IPTG誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下，編碼不同Cas蛋白變體的菌株的生長曲線。
圖5、在NHEJ存在下IS轉(zhuǎn)座到cas基因中。a)示意圖顯示了三個NHEJ系統(tǒng)的組裝，其中包括參與NHEJ修復(fù)的ku和ligD基因。b)在含有ompF（由SpCas9-HF1/sgRNA介導(dǎo)的DSB靶基因）的MG1655-ΔrecA中測定轉(zhuǎn)座頻率，然后進(jìn)行易錯的NHEJ DNA修復(fù)。添加l-阿拉伯糖（10 mM）誘導(dǎo)ku表達(dá)。每個板最多隨機(jī)選擇45個存活菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并計(jì)算每種條件下IS插入SpCas9-HF1編碼區(qū)的比例。
總結(jié)
CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)通過抑制移動遺傳元件的入侵來保護(hù)原核基因組。研究人員篩選了原核基因組序列，并鑒定了插入序列（IS）到cas基因中的多個自然轉(zhuǎn)座，從而滅活CRISPR-Cas防御。使用具有各種IS和誘導(dǎo)型cas核酸酶的大腸桿菌菌株生成了一個IS捕獲系統(tǒng)，以監(jiān)測作為生理宿主應(yīng)激誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂后IS插入cas基因的情況。研究人員鑒定了由不同ISs介導(dǎo)的多個事件，尤其是IS1和IS10，顯示出顯著的松弛靶標(biāo)特異性。在DNA修復(fù)機(jī)制存在的情況下，IS轉(zhuǎn)座到cas中得以維持，并且還檢測到轉(zhuǎn)座到其他宿主防御系統(tǒng)。Bioscreen全自動生長曲線分析儀用于測定不同TIR防御系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)對噬菌體感染的反應(yīng)。通過連續(xù)監(jiān)測細(xì)菌培養(yǎng)的生長情況，研究人員可以識別出在TIR防御系統(tǒng)存在下仍能生長的噬菌體，這些噬菌體可能是通過突變獲得了逃避TIR系統(tǒng)的能力。Bioscreen的使用使得研究人員能夠自動化地完成這些測量和分析，大大提高了實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了IS對抗CRISPR活性的潛力，從而增加細(xì)菌對外源DNA侵襲的易感性。研究還探討了IS在細(xì)菌適應(yīng)性中的角色，包括它們?nèi)绾瓮ㄟ^破壞CRISPR-Cas系統(tǒng)來促進(jìn)有益MGEs的獲取，以及這種機(jī)制如何影響細(xì)菌的進(jìn)化。通過異源表達(dá)特定類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，并構(gòu)建含有特定原間隔序列的質(zhì)粒，研究驗(yàn)證了IS插入對CRISPR-Cas系統(tǒng)的干擾作用。這項(xiàng)研究不僅增進(jìn)了我們對CRISPR-Cas系統(tǒng)和IS之間相互作用的理解，還對抗生素抗性傳播和細(xì)菌進(jìn)化的研究具有重要意義。
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