1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1菌種的保藏及處理將毛霉O-1、M-4接種至察氏瓊脂斜面培養(yǎng)基，曲霉A-1、A-2，酵母Y-11接種至PDA瓊脂斜面培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌KC接種至LB瓊脂斜面培養(yǎng)基，并在對應(yīng)培養(yǎng)條件下活化、培養(yǎng)，活化后在4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.2菌株的篩選將各菌株接種至豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基。真菌置于28℃，細(xì)菌置于37℃培養(yǎng)2d，55℃烘干粉碎，檢測纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和蛋白酶的酶活力。
1.2.3菌株鑒定及保藏菌株采用18S rRNA基因序列測定法進(jìn)行菌株鑒定，由上海美吉公司執(zhí)行。所述菌株已于2015年3月24日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CTCC NO：M2015155。
1.2.4發(fā)酵條件優(yōu)化用無菌生理鹽水將菌種擴(kuò)繁培養(yǎng)基上的孢子洗脫下來，調(diào)節(jié)孢子密度至1×108個/mL，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1mL。設(shè)置4個因素，以不接種的豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，3個重復(fù)，分別優(yōu)化料水比、發(fā)酵溫度、營養(yǎng)因子和發(fā)酵時間。
料水比7個，分別為：1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1、1∶1.1、1∶1.2和1∶1.3，發(fā)酵條件pH不調(diào)節(jié)、28℃、40h。固定料水比1∶1.1，設(shè)置發(fā)酵溫度5個，分別為25、28、31、34和37℃。固定料水比1∶1.1和31℃發(fā)酵溫度，設(shè)置營養(yǎng)因子5個：1%K2HPO4+1%NaCl、2%(NH4)2SO4、2%葡萄糖、2%尿素和2‰K2HPO4+2‰NaCl+2‰(NH4)2SO4+1%葡萄糖+2‰尿素。固定料水比1∶1.1，添加完整營養(yǎng)因子(2‰K2HPO4、2‰NaCl、2‰(NH4)2SO4、1%葡萄糖、2‰尿素)，固定發(fā)酵溫度31℃，設(shè)置發(fā)酵時間6個：22、28、31、34、37和40 h。
發(fā)酵結(jié)束后，55℃烘干，粉碎后密封備用。
1.2.5檢測方法
纖維素酶活力測定參照王琳等的檢測方法；木聚糖酶活力測定參照費(fèi)迪波；果膠酶活力測定參照陳小湘；蛋白酶酶力測定參考趙彩艷；蛋白質(zhì)用凱氏定氮法，可溶性氮總含量的測定用TCA-NSI法。
1.2.6數(shù)據(jù)處理
用SPSS16.0 for windows對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。若差異顯著，則用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05。
2結(jié)果與分析
2.1菌株篩選
不同菌株產(chǎn)酶種類和所產(chǎn)酶的活力不同。比較纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、蛋白酶酶活力篩選菌株。由圖1可知，A-1木聚糖酶活力低于A-2(P<0.05)，但其纖維素酶、果膠酶和蛋白酶活力顯著高于其他菌株(P<0.05)。因此，從整體角度考慮，我們選取A-1為豆粕發(fā)酵菌株。
2.2菌株A-1的鑒定結(jié)果
菌株A-1在PDA平板上的菌落呈橄欖褐色，菌落反面為土黃色至黃褐色，絨毛狀，放射性分布，成熟后產(chǎn)生黃褐色孢子。對A-1的18S rRNA基因序列進(jìn)行測定后再在NCBI中使用Blast進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菌株A-1的18S rRNA基因序列與Aspergillus awamori(KF922319.1,GenBank)和Aspergillus niger(KF758784.1,GenBank)的基因序列同源性為100%，結(jié)合菌株的形體學(xué)特征，確定菌株A-1為泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。
2.3發(fā)酵條件優(yōu)化
研究結(jié)果表明料水比顯著影響A-1發(fā)酵豆粕性能(P<0.05)。料水比從1∶0.7到1∶1.3，A-1先提高發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)含量后降低其含量。料水比1∶1.1時，發(fā)酵性能最好，發(fā)酵豆粕蛋白含量最高(見圖2)。因此，料水比1∶1.1最佳。最佳料水比時，溫度顯著性影響A-1豆粕發(fā)酵性能P<0.05)。從25～37℃，A-1先顯著提高豆粕蛋白質(zhì)含量，然后降低。28和31℃時，發(fā)酵性能最好，顯著提高豆粕蛋白含量(P<0.05)。31比28℃更顯著縮短發(fā)酵時間。因此，31℃為最佳發(fā)酵時間。
圖1不同菌株的酶活力
不同營養(yǎng)鹽也顯著性影響A-1發(fā)酵豆粕性能。2%尿素和全營養(yǎng)成分時，A-1顯著增加豆粕蛋白質(zhì)含量，全營養(yǎng)鹽時可溶性氮指數(shù)(TCA-NSI)最高(見圖3)。因此，最佳營養(yǎng)因子為全營養(yǎng)鹽。發(fā)酵時間顯著影響A-1發(fā)酵豆粕性能。從22～40h，豆粕蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。34和37h時，發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)含量顯著高于時間。37～40h時，發(fā)酵豆粕可溶性氮指數(shù)顯著高于其他時間(P<0.05)。因此，最佳發(fā)酵時間為37h。
綜上，泡盛曲霉的最適發(fā)酵條件為：料水比為1∶1.1，發(fā)酵溫度為31℃，發(fā)酵時間為37h，添加的營養(yǎng)因子為2‰K2HPO4、2‰NaCl、2‰(NH4)2SO4、1%葡萄糖、2‰尿素。
圖2料水比和溫度對A-1發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)含量的影響
圖3營養(yǎng)因子(A)和時間(B)對A-1發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)含量和可溶性氮指數(shù)(TCA-NSI)的影響
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