2結果
2.1大腸桿菌噬菌體的分離鑒定
2.1.1噬菌體的分離及噬菌斑特征
尿液樣品經過濾后的上清液與大腸桿菌K-12指示劑MC1061混合，通過雙層瓊脂平板法鑒定噬菌斑并純化，37℃培養(yǎng)8 h，在平板上可見圓形、邊緣光滑整齊的噬菌斑，中等大小且透明，如圖1所示。
圖1噬菌體vB_EcoS_JA2噬菌斑形態(tài)特征
2.1.2噬菌體的電鏡觀察
純化的噬菌體經2%磷鎢酸負染后，在透射電鏡下所觀察到的形態(tài)如圖2所示。噬菌體vB_EcoS_JA2可見六角形頭部，頭部直徑約40 nm，噬菌體含可收縮性尾部，寬約5 nm、長約110 nm。根據(jù)2012年國際病毒分類委員會第9次報告提出的噬菌體分類與命名標準，該噬菌體符合有尾噬菌體目（）、長尾噬菌體科（）特征。
圖2噬菌體JA2電鏡形態(tài)
2.1.3噬菌體核酸類型鑒定
經DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease處理后，將噬菌體基因組進行核酸電泳鑒定，結果顯示，噬菌體JA2的基因組能被DNase I完全降解，而用RNase A處理不降解，表明其基因組核酸為DNA（圖3）。同時Mung Bean Nuclease處理亦無法降解，表明該噬菌體基因組為雙鏈DNA(dsDNA)。
圖3噬菌體JA2核酸類型鑒定
2.1.4噬菌體的裂菌譜
通過平板裂解實驗及點板實驗（Spot Test Assay）檢測噬菌體對不同細菌的裂解效果。結果發(fā)現(xiàn)，JA2對大腸桿菌K-12菌株MC1061，MG1655和DM1187具有極強的裂解效果，形成明顯的裂菌圈，裂菌圈直徑＞20 mm。同時發(fā)現(xiàn)該噬菌體對臨床分離的UPEC菌株U892、U4208、U4228以及銅綠假單胞菌株U955也有較強的裂菌能力，對大腸桿菌O157菌株Min27，部分UPEC分離株，金黃色葡萄球菌，陰溝腸桿菌等沒有明顯的裂解效果（表1）。
表1噬菌體JA2裂菌譜
菌株類型菌株裂菌活性大腸桿菌K-12菌株E.coli K-12 strainMC1061+++MG1655+++DM1187+++UPEC分離株UPEC isolatesU892++U4208++U4228++U4261-U899-U3486-大腸桿菌O157菌株E.coli O157 isolateMin27-銅綠假單胞菌分離株P.aeruginosa isolateIsolates of enterobacter cloacaeStaphylococcus aureusU955+陰溝腸桿菌分離株Enterobacter cloacae isolateU547-金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus strainATCC43300-
表注：+++：極強裂解性；++：強裂解性；+：弱裂解性；-：不裂解.
2.2大腸桿菌噬菌體的生物學特性
2.2.1噬菌體的最佳感染復數(shù)
分別將噬菌體JA2與指示菌MC1061按照不同的比例混合，培養(yǎng)8 h后，測定培養(yǎng)上清中的噬菌體滴度（表2）。結果表明，當MOI=0.1時，培養(yǎng)后噬菌體滴度最高，表明0.1是該噬菌體的最佳感染復數(shù)。
表2噬菌體JA2最佳MOI測定
編號細菌數(shù)（CFU/mL）噬菌體數(shù)（PFU/mL）感染復數(shù)8h噬菌體滴度（PFU/mL）11×1091×1060.0012.50×108 21×1091×1070.016.34×1010 31×1091×1080.12.15×1012 41×1091×10914.45×1011 51×1081×109108.56×1010 61×1071×1091007.37×109
2.2.2噬菌體的一步生長曲線
如圖4所示，噬菌體JA2感染宿主菌后10 min內噬菌體滴度沒有明顯變化，表明其潛伏期約為10 min，感染后20～60 min內噬菌體的滴度明顯上升，之后趨于穩(wěn)定，表明噬菌體裂解期約為60 min。根據(jù)裂解量（Burst Size）=爆發(fā)末期噬菌體效價（PFU/ml）/感染初期宿主菌濃度（CFU/mL）計算，噬菌體裂解量約為117 PFU/Cell，表明該噬菌體具有極強的裂解和復制能力。
圖4噬菌體JA2的一步生長曲線
2.2.3噬菌體的熱穩(wěn)定性
噬菌體JA2在40～80℃水浴中分別作用30 min后的效價變化情況如圖5所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，噬菌體效價開始明顯下降，溫度到達80℃時噬菌體基本失活。表明該噬菌體具有一定的耐熱性，但高溫容易引起其失活。
圖5噬菌體JA2的熱穩(wěn)定性
2.2.4噬菌體的pH穩(wěn)定性
在不同pH條件下培養(yǎng)1 h后，噬菌體在pH6.0～10.0范圍能保持較高的活性，噬菌體滴度沒有明顯變化，且在pH為7時，噬菌體效價最高。隨著pH值的升高或降低，噬菌體的滴度下降明顯，在pH為2和13時，噬菌體完全失活（圖6）。該結果表明該噬菌體能耐受弱酸和弱堿條件，具有較好的酸堿耐受性。
圖6噬菌體JA2的pH穩(wěn)定性
2.2.5噬菌體對氯仿的敏感性
將噬菌體JA2與分別與含1%，2%，5%氯仿的LB培養(yǎng)基混合，處理30 min后通過雙層瓊脂平板法檢測噬菌體效價。結果顯示，氯仿對噬菌體的滴度有較為明顯的影響，隨著氯仿濃度升高，噬菌體存活率相應降低（圖7），提示該噬菌體對氯仿敏感。
圖7噬菌體JA2對氯仿的敏感性
2.2.6噬菌體JA2對紫外線的敏感性
噬菌體經紫外照射后，按15 min為時間間隔取樣，噬菌體滴度急劇下降，隨著照射時間延長，噬菌體滴度下降幅度平緩（圖8），表明該噬菌體對紫外線較為敏感，但也具有一定的抵抗能力。
圖8噬菌體JA2對紫外線的敏感性
3討論
本研究從臨床尿路感染病例的尿液樣品中分離得到了1株大腸桿菌噬菌體，根據(jù)其形態(tài)特征和生物學特性，將其命名為vB_EcoS_JA2，其中vB：viruses Bacteriophage（病毒噬菌體）；Eco：（大腸桿菌）；S：（長尾噬菌體科），JA2為分離噬菌體的編號。對噬菌體JA2的初步鑒定和生物學特性研究結果顯示，該噬菌體在平板上形成的噬菌斑邊緣整齊且清晰。噬菌體JA2對大腸桿菌K-12菌株、UPEC分離株具有明顯的裂菌效果。噬菌體JA2在40～60℃具有較好的穩(wěn)定性，對紫外線具有一定的抵抗力，其最佳感染復數(shù)為0.1。同時，該噬菌體一步生長曲線顯示，其潛伏期約為10 min，爆發(fā)期約為60 min，裂解量約為124 PFU/Cell，表明JA2噬菌體具有極強的裂解和復制能力。
目前，大量的抗生素使用甚至濫用，這是導致耐藥性細菌頻發(fā)、“超級細菌”產生的元兇。廣譜抗生素濫用導致的正常菌群損傷、細菌耐藥性問題對公共衛(wèi)生安全危害極大。耐藥性細菌的出現(xiàn)，極大的增加了細菌感染性疾病，尤其是尿路致病性大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌感染的治療難度。此外，UPEC臨床菌株不斷增強的抗生素耐藥性，尤其是近來出現(xiàn)的對碳青霉烯類和粘菌素類抗生素的耐藥性，使得UTI成為抗生素耐藥的又一重災區(qū)，迫切需要尋找新的治療和預防手段加以防控。為此，探索不易引起耐藥和殘留的噬菌體抗菌治療（Phage therapy）策略成為國內外研究熱點。
裂解性噬菌體是特異性感染并殺滅細菌的病毒，其具有殺菌效率高、副作用少、宿主譜窄等特點，不會破壞機體正常菌群，在抗細菌感染中具有巨大潛力，因此在細菌耐藥形勢日益嚴峻的今日，開發(fā)噬菌體抗菌制劑已引發(fā)全球關注。2018年8月，上海噬菌體與耐藥研究所噬菌體治療團隊成功完成了一例針對復雜性、反復性多重耐藥肺炎克雷伯菌尿路感染患者的治療，展示了噬菌體在治療多重耐藥菌感染、復發(fā)性尿路感染的強大潛力。本研究從尿液樣品中分離的噬菌體JA2，UPEC臨床分離株具有很好的裂解能力，且具有較好的穩(wěn)定性，它是研究治療耐藥性細菌尿路感染的良好實驗材料。