摘要：采集受草銨膦污染的香蕉園土壤，通過(guò)富集培養(yǎng)技術(shù)獲得以草銨膦為唯一碳源生長(zhǎng)的微生物C6菌株。結(jié)果表明，C6菌株對(duì)草銨膦降解率高達(dá)69.01%；通過(guò)觀察C6菌株的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合16S rRNA序列分析，初步鑒定C6菌株為戴爾福特菌屬（Delftiasp.）；進(jìn)一步探討培養(yǎng)基體積、氮源、草銨膦初始濃度、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、菌懸液接種量、Na+濃度和Mg2+濃度等因素對(duì)C6菌株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，C6菌株最適宜的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)基體積為75 mL、氮源為硫酸銨、草銨膦初始濃度200 mg·L-1、初始pH值8.5、培養(yǎng)溫度25℃、接種量15%、Na+濃度20 g·L-1、Mg2+濃度100 mg·L-1。本研究結(jié)果為利用微生物對(duì)草銨膦污染土壤進(jìn)行原位生物修復(fù)提供理論依據(jù)。
草銨膦（Glufosinate ammonium）又稱草丁膦，化學(xué)名為4-［羥基（甲基）膦酰基］-DL-高丙氨酸，化學(xué)式為C5H15N2O4P，是一種廣譜型除草劑，具低毒、活性高和環(huán)境相容性好等特點(diǎn)。草銨膦通過(guò)與植物體中的ATP相結(jié)合并占據(jù)谷氨酰胺合成酶（glutamine aynthetase，GS）的反應(yīng)位點(diǎn)，在植物氮代謝過(guò)程中阻礙谷氨酸與銨離子合成谷氨酰胺的途徑并隨之破壞其后的代謝過(guò)程。主要?jiǎng)┬蜑槿芤簞ㄋ畡?，由于其殺草譜廣、發(fā)揮活性作用速度較快，廣泛應(yīng)用于果園、馬鈴薯以及非耕地等田間雜草的治理。
目前因一系列高毒性除草劑（百草枯、草甘膦等）的禁用，以及農(nóng)用除草劑的市場(chǎng)高需求，草銨膦作為低毒、高活性的廣譜除草劑，其生產(chǎn)量和使用量均居世界前列。隨著使用量的增加，且具有較強(qiáng)的水溶性，容易污染水源并進(jìn)一步在食物鏈中富集，對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在威脅，有效降低這些威脅成為目前迫切需要解決的問(wèn)題。微生物降解是農(nóng)藥殘留被降解轉(zhuǎn)換的主要途徑之一，具有適用范圍廣泛、代謝方式多樣且相較于物理、化學(xué)降解更安全、綠色和有效，因此研究和應(yīng)用的前景十分廣闊。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外關(guān)于草銨膦的研究主要集中在作用機(jī)理以及在不同環(huán)境中的行為、毒性等方面，而對(duì)草銨膦的降解菌株及相關(guān)降解菌株的生長(zhǎng)特性方面的研究尚少。本研究旨在從受草銨膦污染的香蕉果園土壤中分離、篩選可降解草銨膦的微生物菌株，并對(duì)草銨膦降解菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，以期為草銨膦微生物降解的深入研究和草銨膦降解菌的產(chǎn)業(yè)化利用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1供試土壤
福建省漳州市長(zhǎng)泰縣常年施用草銨膦的香蕉園，拔除土壤表層雜草和其它雜物后取0～15 cm土樣，迅速取回，置于4℃冰箱保存。
1.1.2培養(yǎng)基
以草銨膦為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，每1 L蒸餾水中組分構(gòu)成為MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.31 g、FeSO4·7H2O 0.018 g、NaNO3 3.0 g。外加草銨膦用于培養(yǎng)和分離草銨膦降解菌株。LB培養(yǎng)基為10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母粉、NaCl 5.0 g。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基為牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L，pH值7.0～7.2。
1.1.3草銨膦
草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品（阿拉丁/G114499-100 mg），購(gòu)自阿拉丁官網(wǎng)。
1.1.4主要儀器
電子天平（奧豪斯/AR224CN）、超凈工作臺(tái)（蘇州安泰/SW-CJ-2FD）、臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭/TGL-16C）、立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安/LDZM-80L）、基礎(chǔ)型超純水系統(tǒng)（上海澤拉布/Dura 12FV）、振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚/ZQZY-75CN）、生化培養(yǎng)箱（寧波賽福/SPX-250）、pH計(jì)（上海儀電/PHS-3C）、超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（安捷倫/1290-6545）、光學(xué)顯微鏡（Ci-L，日本）。
1.2草銨膦降解菌株的富集和分離純化
降解菌株的分離純化在參考吳紅萍等方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改良。取10 g土壤加入含有100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，外加草銨膦50 mg·mL-1，在生化培養(yǎng)箱中以30℃恒溫、150 r·min-1的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3 d。取10 mL上層懸浮液加入到100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)上述培養(yǎng)操作至草銨膦濃度為300 mg·mL-1，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3個(gè)周期。待培養(yǎng)周期結(jié)束后，梯度稀釋樣液，并吸取100μg稀釋液涂布于改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，分別在30℃和37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1～7 d。待菌落長(zhǎng)出后，進(jìn)行觀察，用接種環(huán)在分離較好且菌落形態(tài)不同的單一菌落上沾取少量菌體放入液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行平板劃線，恒溫培養(yǎng)結(jié)束后放入冰箱保存?zhèn)溆谩?
1.3高效降解菌株的篩選
菌株接種到液體培養(yǎng)基中制備懸浮菌液，于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，以10%接菌量接種到100 mL含300 mg·L-1草銨膦基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，再于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1個(gè)周期。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取2 mL于2.5 mL具塞離心管中，置于臺(tái)式高速離心機(jī)中，以10 000 r·min-1離心10 min，通過(guò)0.22μm超濾膜過(guò)濾上清液1～1.5 mL到樣品管中，用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定，另設(shè)置未添加微生物降解菌株的草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照組，計(jì)算菌株的降解率（％）=（C0-Ct）／C0×100％，式中C0為草銨膦初始濃度，Ct為不同菌株降解作用下草銨膦的濃度。
1.4草銨膦降解菌株的形態(tài)與分子鑒定
采用平板涂布法將篩選后的草銨膦降解菌株，在生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)12～48 h。參照《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等對(duì)降解菌株的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察。
進(jìn)一步采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACCCTT-3）擴(kuò)增菌株序列，并送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得基因序列在NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，選取同源性較高的菌株序列，采用MEGA7.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.5草銨膦降解菌株的生長(zhǎng)因素優(yōu)化
草銨膦降解菌株生長(zhǎng)因子優(yōu)化采用Liu等方法。將降解菌株接種在50 mL的LB液體培養(yǎng)基（pH值7.0）中，在30℃、150 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)18～24 h（OD600=0.30），再按5%（V/V）的量接種于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，初始pH值為7.0，初始草銨膦濃度為50 mg·L-1、溫度為30℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，分別進(jìn)行以下幾組處理測(cè)定生長(zhǎng)量的變化，每種因素設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，以接種滅活的菌株為對(duì)照組，24 h后取樣測(cè)定菌株生長(zhǎng)量變化。
設(shè)培養(yǎng)基體積分別為25、50、75、100、150、200 mL；設(shè)氮源分別為硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉；設(shè)草銨膦初始濃度分別為10、50、100、200、300、400、500 mg·L-1；用NaOH或HCl調(diào)節(jié)初始pH值分別至4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0；設(shè)培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、35、40、45℃；設(shè)接種量分別為5%、10%、15%、20%、25%；將菌懸液按5%接種量接入含有草銨膦降解培養(yǎng)基的錐形瓶中，調(diào)節(jié)初始pH值7.0、7.5，在30℃、150 r·min-1條件下分別加入5、10、20、30、50、100 g·L-1氯化鈉培養(yǎng)1 d后測(cè)定草銨膦降解率，重復(fù)3次，確定最適Na+濃度。同樣設(shè)置Mg2+濃度分別為50、100、200、300、400 mg·L-1。
香蕉果園土壤中分離的草銨膦降解菌株生長(zhǎng)特性（一）
香蕉果園土壤中分離的草銨膦降解菌株生長(zhǎng)特性（二）
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