SMu0629是AtlA正常生產(chǎn)所必需的。 使用全細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE和Western印跡分析顯示，SMu0629基因的破壞顯著影響了AtlA的生產(chǎn)和加工。特別是，與UA159相比，629NP和629P突變體中AtlA加工形式的數(shù)量顯著減少，因此atlA轉(zhuǎn)錄減少可能不是觀察結(jié)果的原因。由于AtlA被認(rèn)為是變形鏈球菌的主要自溶素，我們檢查了突變菌株在44°C的自溶活性。如圖3D所示，629NP和629P突變體都顯示出較低的自溶速率，類似于atlA缺陷突變體。因此，很可能缺乏SMu0629的菌株中AtlA成熟效率降低導(dǎo)致自溶減少，除非SMu0629可以直接參與細(xì)胞自溶或影響其他肽聚糖水解酶的活性。
圖3. SMu0629突變體（非極性突變629NP和極性突變629P）的表型特征分析。（A）通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測atlA基因表達(dá)。使用UA159（野生型）、629NP和629P菌株的總RNA，采用630反向引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)測定atlA mRNA。（B）生物膜形成能力。菌株在補(bǔ)充葡萄糖的BM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1或2天。數(shù)據(jù)代表至少進(jìn)行三次重復(fù)的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。*表示P<0.01（1天）或P<0.001（2天）（學(xué)生t檢驗(yàn)）。（C）變異鏈球菌野生型（WT）和兩種SMu0629突變體（629NP和629P）的珠磨-SDS煮沸提取物SDS-PAGE分析。經(jīng)SDS-PAGE后，蛋白質(zhì)分別用考馬斯亮藍(lán)染色（上圖）或轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜并使用1:350稀釋度的抗630D1多克隆抗血清進(jìn)行Western blotting（下圖）。M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。（D）自溶實(shí)驗(yàn)。菌株自溶活性在Bioscreen C系統(tǒng)中監(jiān)測，該系統(tǒng)設(shè)置為每30分鐘檢測前震蕩15秒。細(xì)胞懸浮液在AtlA自溶最適溫度（44°C）下培養(yǎng)。黑色線：UA159；灰色線：629NP；灰色虛線：629P。
我們先前證明，AtlA缺陷菌株的缺陷可以通過向atlA突變體培養(yǎng)物中添加少至2 ng ml-1的純化AtlA蛋白來糾正至野生型水平，并且在這些條件下全長蛋白可以加工為79 kDa形式。當(dāng)將純化的His標(biāo)簽AtlA蛋白以2.0 ng ml-1的濃度添加到630P和SAB95培養(yǎng)物時(shí)，產(chǎn)生正常長度鏈的能力得到恢復(fù)，并且缺乏SMu0629的菌株仍然可以將107 kDa形式轉(zhuǎn)化為AtlA的成熟形式，表明SMu0629可能在分泌或定位過程中對AtlA生物發(fā)生重要，但不直接參與AtlA在細(xì)胞表面的加工。此外，盡管SMu0629是AtlA高效表達(dá)和加工所必需的，但在測試條件下可能有足夠水平的正確加工AtlA可用以表達(dá)評估的表型。
SMu0629基因突變體對氧氣更敏感。 SMu0629功能的一個假設(shè)是，憑借其與硫醇-二硫鍵氧化還原酶的序列相似性，它參與變形鏈球菌對氧化環(huán)境的適應(yīng)，可能通過感知氧化還原狀態(tài)和調(diào)節(jié)AtlA的成熟。由于該蛋白家族的某些成員保護(hù)細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激或參與細(xì)胞氧化還原活性，測試了SMu0629基因突變體對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。用0.2% H2O2處理的H2O2殺傷實(shí)驗(yàn)未顯示指數(shù)生長期中期629NP、629P或親本菌株存活的顯著差異。
圖4. 變形鏈球菌菌株（UA159、629NP和629P）需氧生長的影響。需氧培養(yǎng)采用旋轉(zhuǎn)搖床（150 rpm）進(jìn)行。（A）生長曲線。菌株在37°C的BHI培養(yǎng)基中生長，所示數(shù)據(jù)來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中具有代表性的一次實(shí)驗(yàn)，且三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。（B）生物膜形成。菌株在補(bǔ)充有終濃度為20 mM葡萄糖的BM培養(yǎng)基中，通過搖床（150 rpm）進(jìn)行需氧培養(yǎng)。更多細(xì)節(jié)見正文。數(shù)據(jù)代表至少兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次或以上）的結(jié)果。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。*，P < 0.001（學(xué)生t檢驗(yàn)）。
當(dāng)在通氣條件下生長時(shí)，缺乏SMu0629的菌株顯示出顯著較低的生長速率，并且比野生型形成更多聚集體。使用Bioscreen系統(tǒng)獲得的結(jié)果通過試管中的生長確認(rèn)，以確保較低的生長速率不是細(xì)胞聚集的假象。此外，SMu0629基因的破壞使生物體在氧氣存在下比野生型菌株形成更多生物膜，類似于atlA突變菌株?？傊覀兊慕Y(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞暴露于氧氣時(shí)，SMu0629基因突變體和野生型菌株之間存在顯著的表型差異。
VicK傳感器激酶影響SMu0629基因表達(dá)和AtlA成熟。 VicRK TCS被研究作為atlA操縱子或AtlA活性的可能調(diào)節(jié)系統(tǒng)。變形鏈球菌的Vic系統(tǒng)，對某些相關(guān)物種指定為CovRS，最近被顯示調(diào)節(jié)葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因（gtfBCD）、果糖基轉(zhuǎn)移酶基因（ftf）和gbpB的表達(dá)，后者編碼葡聚糖結(jié)合蛋白B。這些基因產(chǎn)物密切參與外多糖生產(chǎn)，而Gtfs和Gbps尤其對蔗糖依賴性粘附和生物膜形成至關(guān)重要。Vic的缺失影響變形鏈球菌生長、蔗糖依賴性粘附、生物膜形成和遺傳能力發(fā)展。在變形鏈球菌UA159的vicK基因中產(chǎn)生缺失突變。vicRKX基因座中的所有三個基因被顯示在一個操縱子中，因此vicK通過非極性插入（vicK-NP）破壞。由于我們無法分離vicR無效突變體，vicK-NP在本研究中用作Vic缺陷菌株。該突變菌株具有改變的生長速率，并在靜態(tài)生長期間在試管底部聚集。突變體形成生物膜的能力在BM-葡萄糖和BM-蔗糖培養(yǎng)基中顯著降低，證實(shí)了先前研究中的觀察。
圖5. vicK突變體(vicK-NP)的表型特征分析。(A)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SMu0629和atlA基因的表達(dá)。使用UA159(野生型)和vicK-NP菌株的總RNA，分別采用629-反義引物和630-反義引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(誤差線)。*表示P<0.05(學(xué)生t檢驗(yàn))。(B)野生型(WT)與vicK-NP變異鏈球菌菌株兩種不同細(xì)胞提取物的SDS-PAGE分析。經(jīng)過SDS-PAGE后，蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍(lán)染色(左圖)或轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜進(jìn)行Western blotting(全細(xì)胞裂解液)分析，使用1:350稀釋度的抗630D1多克隆抗血清(右圖)。M泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。從染色凝膠中切取目標(biāo)條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析。(C)自溶實(shí)驗(yàn)。在Bioscreen C系統(tǒng)中監(jiān)測菌株的自溶活性，該系統(tǒng)設(shè)置為每30分鐘檢測前震蕩15秒。細(xì)胞懸浮液在AtlA自溶活性的最適溫度(44°C)下培養(yǎng)。粗線代表UA159；細(xì)灰線代表vicK-NP。
為了研究VicK對atlA操縱子的調(diào)節(jié)功能，我們首先比較了vicK突變體和野生型菌株中SMu0629基因和atlA的表達(dá)（圖5A）。SMu0629基因的表達(dá)在vicK-NP菌株中減少約40%（P < 0.02），atlA的表達(dá)減少約35%（P < 0.007）。更重要的是，如使用全細(xì)胞裂解物和表面蛋白的4% SDS提取物的SDS-PAGE和Western印跡分析所示，vicK的缺陷導(dǎo)致AtlA（107 kDa）加工為其成熟形式（79 kDa）的幾乎完全抑制（圖5B），并導(dǎo)致對自溶的顯著抗性（圖5C）。
有趣的是，從4% SDS提取部分明顯看出，幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)或定位在vicK突變體中顯著受影響。特別值得注意的是，兩個條帶，大約150 kDa和70 kDa，在突變體中比野生型菌株數(shù)量多得多（圖5B）。為了鑒定這兩個條帶，將它們從染色凝膠中切下，并通過基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析胰蛋白酶消化模式。較大的條帶被鑒定為GtfC，較小的蛋白質(zhì)被鑒定為與戈登鏈球菌推定N-乙酰胞壁酰胺酶/溶素和肺炎鏈球菌膽堿結(jié)合蛋白D同源的細(xì)胞壁蛋白前體蛋白（SMu0555）。因此，這些結(jié)果表明Vic系統(tǒng)直接或間接控制毒力因子的定位或表達(dá)，包括Gtfs和自溶素。
圖6. 變異鏈球菌菌株（UA159和vicK-NP）需氧生長效應(yīng)。需氧培養(yǎng)采用旋轉(zhuǎn)搖床（150 rpm）進(jìn)行。（A）生物膜形成。菌株在添加20 mM蔗糖的BM培養(yǎng)基中生長，通過結(jié)晶紫染色法在聚苯乙烯微孔板上檢測生物膜形成情況。（B）采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測需氧生長條件下變異鏈球菌UA159中SMu0629、atlA和vicR基因的差異表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示為三次及以上獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*表示P<0.02（學(xué)生t檢驗(yàn)）。
氧氣對vicK突變體的影響。 有趣的是，與atlA突變體的情況相似，當(dāng)細(xì)胞在通氣條件下生長時(shí)，vicK突變體的長鏈和細(xì)胞聚集特征顯著減弱，接近野生型水平。此外，在相同條件下，與野生型相比，vicK突變體在BM-蔗糖培養(yǎng)基中顯示出顯著增加的生物膜形成（圖6A）。盡管vicK突變體的表型受氧氣顯著影響，但vicK基因的表達(dá)在氧氣存在或不存在下沒有差異（圖6B）。然而，SMu0629基因（P = 0.05）和atlA（P = 0.003）的表達(dá)在氧氣存在下顯著降低（圖6B）。