摘要
生物膜通常是慢性人類感染的原因，并污染工業(yè)或醫(yī)療設(shè)備。傳統(tǒng)方法是使用增加濃度的抗生素，但微生物迅速對其產(chǎn)生多重耐藥性。因此，我們研究了使用天然物質(zhì)作為替代解決方案?；诙ㄖ矃^(qū)域的生物膜定量使用配備圖像分析軟件的Cellavista自動顯微鏡進行測量。
使用Cellavista設(shè)備為固著細胞的定性和定量帶來了新的可能性。在我們的研究中，通過探索兩性霉素B、黃芩素、殼聚糖和地衣酸對酵母生物膜形成的抗真菌/抗生物膜活性，記錄了這一特性。
在96孔聚苯乙烯微孔板中研究了這些物質(zhì)對機會致病酵母近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌生物膜形成和根除的影響。雖然兩性霉素B不是很有效，但發(fā)現(xiàn)使用黃芩素和殼聚糖，即使在最小抑制濃度下，也能迅速減少孔中的定植區(qū)域。地衣酸即使在濃度300μg ml?1下也未顯示任何顯著的抗生物膜特性。我們的結(jié)果表明Cellavista是研究酵母生物膜形成和抗菌劑效果的有前途的工具。
1.引言
生物膜是高度組織化的基質(zhì)包裹微生物群落，不可逆地附著于表面、相界面或彼此。這些微生物群落經(jīng)常污染醫(yī)療儀器或工業(yè)設(shè)備，并引起廣泛的人類感染。治療這些感染的一大問題是生物膜對常用抗生素的高抗菌耐藥性。生物膜中的微生物比浮游細胞更具耐藥性。
自然界中幾乎99%的微生物能夠以生物膜形式生長，在其中定植各種表面。細菌生物膜及其相關(guān)感染通常比其他微生物引起的生物膜得到更廣泛探索。然而，酵母生物膜，尤其是念珠菌屬生物膜，也能引起非常嚴(yán)重的人類感染。
念珠菌屬是從醫(yī)院感染或醫(yī)療儀器上形成的生物膜中最常分離的酵母之一。白念珠菌通常被指定為最廣泛傳播的機會致病酵母，但近平滑念珠菌已成為許多研究中日益關(guān)注的主題。近平滑念珠菌引起多種疾病，特別是在免疫缺陷患者中。這些疾病包括真菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、眼部感染、外陰陰道炎、尿路感染和關(guān)節(jié)疾病。雖然一些近平滑念珠菌菌株對多烯抗菌劑敏感，但其他已產(chǎn)生耐藥性?？唆斔鼓钪榫徽J(rèn)為致病性較低但比其他念珠菌屬更疏水。這一因素在導(dǎo)致宿主表面定植的初始事件中起重要作用。在此背景下，該酵母物種能夠引起一系列臨床表現(xiàn)，如真菌血癥、眼內(nèi)炎、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎。
仍然廣泛用于抗真菌感染的抗生素是多烯抗生素兩性霉素B，盡管它有相當(dāng)嚴(yán)重的副作用。最嚴(yán)重的是腎毒性，可能導(dǎo)致腎衰竭。
因此，注意力轉(zhuǎn)向使用具有抗菌、抗真菌和抗生物膜特性的天然物質(zhì)，這些物質(zhì)可能有助于治療酵母生物膜感染。這些物質(zhì)可以低濃度使用，對患者無負(fù)面影響，且不會產(chǎn)生耐藥性。此類天然物質(zhì)的例子包括多酚、黃酮類、二苯乙烯類、萜類、多糖和常用香料的活性化合物。
多種顯微鏡技術(shù)已用于研究生物膜。這些方法包括光學(xué)顯微鏡、掃描激光共聚焦顯微鏡、掃描和透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡等。光學(xué)顯微鏡結(jié)合圖像分析將生物膜視為粘附細胞覆蓋的二維區(qū)域，被認(rèn)為是生物膜觀察的基本方法。光學(xué)顯微鏡和圖像分析的結(jié)合已用于評估粘附細胞數(shù)量、面積覆蓋度、次要應(yīng)用包括確定粘附細胞的生物體積以及實時觀察細菌粘附和生物膜生長。
本文的目的是報告應(yīng)用Cellavista設(shè)備作為一種新方法研究酵母生物膜及其對抗菌劑響應(yīng)的可能性。該應(yīng)用通過觀察用天然物質(zhì)而非抗生素處理真菌生物膜來證明。Cellavista自動顯微鏡在生物膜分析中的優(yōu)勢之一是可以自動拼接單個圖片并隨后對這些大表面進行圖像分析。這通過消除生物膜的自然變異性以及檢測不同生物膜排列的變化（例如由于生物膜環(huán)境中天然物質(zhì)的存在）顯著細化最終結(jié)果。使用Cellavista設(shè)備提供的圖像分析，我們顯示黃芩素、殼聚糖和地衣酸在治療近平滑念珠菌和克魯斯念珠菌生物膜中的積極作用，并將此類處理與兩性霉素B的效果進行比較，從而證明Cellavista可作為快速、可靠的工具用于確定抗菌劑對生物膜的效率。
2.方法
2.1.真菌菌株和生長培養(yǎng)基
近平滑念珠菌DBM 2165和克魯斯念珠菌DBM 2163由UCT Prague微生物收藏庫友好提供。儲備培養(yǎng)物在-70°C儲存，并在每次實驗前在30°C麥芽提取物培養(yǎng)基中好氧預(yù)培養(yǎng)。實驗也在麥芽提取物生長培養(yǎng)基中進行。
2.2.抗真菌劑
黃芩素、殼聚糖、地衣酸和兩性霉素B購自Sigma-Aldrich。黃芩素和地衣酸溶解于DMSO（所有測定中培養(yǎng)基中DMSO最終濃度最高為1%）至濃度0.004和0.03μg ml?1，殼聚糖通過溶解于少量乙酸（最多總體積的2%）然后在無菌蒸餾水中至濃度0.073μg ml?1制備，兩性霉素B溶解于無菌蒸餾水至濃度0.029μg ml?1。每種物質(zhì)在4°C儲存直至使用（最多一周）。
2.3.抗真菌活性
黃芩素、殼聚糖、地衣酸和兩性霉素B的最小抑制濃度通過微量稀釋法測定。培養(yǎng)在100孔微孔板中使用Bioscreen C生長曲線分析儀進行，通過監(jiān)測光密度（OD寬波段=420-580 nm）。將30μl標(biāo)準(zhǔn)酵母細胞懸浮液（OD600 nm=0.1）加入板每孔。包括無藥物和無酵母對照。板在30°C孵化24小時。MIC指定為孵化過夜后不允許可見生長的最低濃度。實驗對每種濃度進行五個重復(fù)孔。
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