通過Box-Behnken優(yōu)化培養(yǎng)基組成
根據(jù)上述結(jié)果，選擇顯著自變量[即蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）和MnSO4·H2O（X3）]用于Box-Behnken設(shè)計(jì)。相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表4所示。結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析，如表S1所示。模型的充分性通過確定系數(shù)評(píng)估。該模型呈現(xiàn)相對(duì)較高的F值（2522.51）、非常低的概率值（P>F=0.0001）和高系數(shù)（R2=0.9997），解釋99.97%的響應(yīng)變異性。X1、X2和X3的最佳濃度分別為25 g/L、24.86 g/L和0.2 g/L，導(dǎo)致最大理論OD600為1.78（表4）。為確認(rèn)這些結(jié)果，在預(yù)測培養(yǎng)基條件下進(jìn)行了額外的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，生物量平均值為1.772，與預(yù)測值一致。該優(yōu)化策略使生物量從OD600 1.611提高至1.772。
MRS中微量元素對(duì)細(xì)胞生長的影響
根據(jù)表3中正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的ANOVA分析，MRS培養(yǎng)基中的許多微量元素，如K2HPO4、CH3COONa、MgSO4和檸檬酸銨，被認(rèn)為對(duì)鼠李糖乳桿菌ZY的生物量沒有顯著影響。因此，進(jìn)一步研究了從MRS培養(yǎng)基中簡單去除這些微量元素的經(jīng)濟(jì)策略。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表5所示，針對(duì)以下培養(yǎng)基組成：原始MRS、OPT、無檸檬酸銨、或無K2HPO4、或無CH3COONa、或無MgSO4、以及無MRS中四種元素（mini-MRS）。微量元素對(duì)特定生長速率和最大生物量的影響如表5所示。顯著影響特定生長速率的關(guān)鍵微量元素排序?yàn)椋簷幟仕徜@ > CH3COONa > MgSO4和K2HPO4。最后，在mini-MRS中發(fā)生最小OD600為1.339，其中去除了所有四種微量元素。如圖2所示，鼠李糖乳桿菌ZY在6小時(shí)前的早期階段在各種條件下生長相似。最后，在MRS、OPT和mini-MRS培養(yǎng)基中顯示出生物量和特定生長速率的主要差異。這表明單個(gè)微量元素對(duì)細(xì)胞生長的影響略微顯著，而總微量元素或含有補(bǔ)充來源也顯著參與乳桿菌代謝。
細(xì)胞表面表征和蛋白質(zhì)分析
代表在不同發(fā)酵條件下生長的細(xì)菌細(xì)胞的ATR-FTIR光譜。大分子功能群對(duì)應(yīng)的吸收帶分配總結(jié)在表S2中。在樣本中，在光譜的碳水化合物區(qū)域（1200-950 cm-1）以及對(duì)應(yīng)于磷酸鹽（~1225 cm-1）拉伸、酰胺I和II帶中C=O和C-N基團(tuán)的區(qū)域觀察到細(xì)微差異。這些結(jié)果表明細(xì)胞表面成分發(fā)生構(gòu)象變化。然而，在不同培養(yǎng)條件下處理的樣本中未觀察到鼠李糖乳桿菌ZY表面特性的明顯影響。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵特性（包括生長培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度和pH）也影響細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞特性。因此，本研究采用FTIR光譜技術(shù)，該技術(shù)通過先進(jìn)的化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)系統(tǒng)革新，從高光譜數(shù)據(jù)中提?。ㄉ铮┗瘜W(xué)信息，以研究培養(yǎng)基對(duì)鼠李糖乳桿菌ZY表面特性的影響。
此外，總細(xì)胞蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析，隨后進(jìn)行聚類分析，如圖4所示。這些結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌ZY在6小時(shí)具有相似的蛋白質(zhì)模式，這與MRS、OPT和mini-MRS培養(yǎng)基在早期生長階段的特定生長速率一致（圖2），而三種條件下24小時(shí)的蛋白質(zhì)譜不同。選擇條帶10作為Quantity One分析的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，隨后使用PermutMatrix軟件進(jìn)行雙向?qū)哟尉垲惙治?。如圖4B所示，條帶6、17和18對(duì)應(yīng)于來自MRS培養(yǎng)的ZY菌株中的不同蛋白質(zhì)（即黑色和紅色條帶）。條帶6的蛋白質(zhì)在MRS中明顯顯示比OPT和mini-MRS培養(yǎng)條件下濃度更高，而條帶17和18的蛋白質(zhì)濃度在OPT培養(yǎng)基中略高。因此，通過MALDI-TOF-TOF進(jìn)一步分析四種選定蛋白質(zhì)。詳細(xì)的Mascot鑒定信息（表6）表明，通過質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)6是分子伴侶DnaK，蛋白質(zhì)10是伴侶蛋白GroEL，蛋白質(zhì)17是塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶，蛋白質(zhì)18是30S核糖體蛋白S2。MRS培養(yǎng)基中的差異蛋白DnaK協(xié)助新生多肽鏈折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)重折疊。關(guān)于塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶和核糖體蛋白，這些蛋白質(zhì)受環(huán)境條件高度調(diào)控，以有效利用碳源，例如通過利用OPT培養(yǎng)基中更大量的葡萄糖。由于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可用于從復(fù)雜培養(yǎng)條件中發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)，并從新菌株中發(fā)現(xiàn)新酶，我們的結(jié)果通過這種替代蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步確定MRS培養(yǎng)基中對(duì)乳桿菌關(guān)鍵的成分是與碳源濃度相關(guān)的那些。通過轉(zhuǎn)錄水平檢測關(guān)鍵因素濃度影響細(xì)胞生長的進(jìn)一步研究是必要的。
結(jié)論
本研究通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成功解析了MRS培養(yǎng)基中各成分對(duì)鼠李糖乳桿菌ZY生長的影響，確定了葡萄糖、MnSO4·H2O和牛肉浸膏為最關(guān)鍵因素。通過Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化后，生物量從OD600 1.611顯著提高至1.772。研究還發(fā)現(xiàn)，雖然單個(gè)微量元素對(duì)生長影響不顯著，但完全去除微量元素會(huì)顯著抑制生長。FTIR和蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，不同培養(yǎng)基條件會(huì)影響細(xì)胞表面特性和蛋白質(zhì)表達(dá)，特別是與碳源利用相關(guān)的蛋白質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化乳桿菌培養(yǎng)條件提供了重要理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。
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