摘要：目前微生物生長量的測(cè)定有多種方法。根據(jù)微生物的種類、形態(tài)特征、代謝特性等的差異可以選擇不同的測(cè)定方法。以細(xì)菌、真菌、放線菌為主體，從微生物數(shù)量、微生物重量、群體生理指標(biāo)三個(gè)方向出發(fā)，通過對(duì)三種類別微生物生長量測(cè)定常用方法的比較研究，總結(jié)各方法的優(yōu)劣以及使用條件，為之后實(shí)驗(yàn)室里能夠更加準(zhǔn)確地依靠生長量測(cè)定某種特定微生物的生長曲線提供指導(dǎo)。
微生物生長曲線通常是指以微生物生長量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)所繪制的曲線。其是描述微生物生長狀況的基本指標(biāo)。一條典型的生長曲線可以分為延緩期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)生長時(shí)期[1]。處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，微生物生命力旺盛，世代時(shí)最短而穩(wěn)定，細(xì)胞數(shù)量成倍地增加。所以對(duì)數(shù)期常用于發(fā)酵與微生物培養(yǎng)。處于穩(wěn)定期時(shí)，微生物代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)出并累積。生產(chǎn)應(yīng)用中，可以通過延長穩(wěn)定期來獲得更多所需要的代謝產(chǎn)物。微生物生長量測(cè)定的準(zhǔn)確度直接決定了其生長曲線測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，而準(zhǔn)確地測(cè)定微生物生長曲線對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐有著重大的指導(dǎo)意義。
目前微生物生長量的測(cè)定大致可以分為三類：微生物數(shù)量的測(cè)定，微生物重量的測(cè)定和群體生理指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定微生物數(shù)量的方法包括顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、稀釋平板計(jì)數(shù)法、稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法（最大概率法）、比濁法。測(cè)定微生物重量的方法主要指稱重法。群體生理指標(biāo)法指通過測(cè)定微生物群體所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)或者代謝產(chǎn)物來確定其微生物生長量，例如底物葡萄糖法、含氮量測(cè)定法、生物活性測(cè)定法等。在實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐生產(chǎn)中如何在眾多方法中正確選擇一種可以更加準(zhǔn)確、簡便地測(cè)定特定微生物的生長量是至關(guān)重要的。
1、微生物數(shù)量測(cè)定方法
1.1顯微鏡直接計(jì)數(shù)法
顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將適量待測(cè)微生物樣品懸濁液置于一種特制的有固定面積和體積的計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下直接對(duì)微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)的快捷簡便的方法。
目前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)主要有兩類計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌可采用細(xì)菌計(jì)數(shù)板，菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板。兩類計(jì)數(shù)板的原理、使用方法相同，只是較薄的細(xì)菌計(jì)數(shù)板使用油鏡觀察更佳[2]。在具體的實(shí)驗(yàn)過程中微生物懸濁液需要用無菌水稀釋至適當(dāng)濃度，以讓每小格的菌數(shù)達(dá)到可以進(jìn)行計(jì)數(shù)的范圍內(nèi)。依據(jù)每小格中微生物的數(shù)量換算成每毫升或每克菌液樣品中的微生物數(shù)量，即生長量。該方法主要的缺陷是測(cè)得的是菌體總數(shù)，不能區(qū)分活死菌。針對(duì)這一缺陷，張霞等對(duì)微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行點(diǎn)滴改進(jìn)研究出了一種美蘭水浸片法，通過使用0.1%美蘭染液對(duì)酵母菌進(jìn)行染色將死、活細(xì)胞區(qū)別開來從而降低計(jì)數(shù)的誤差[3]。
1.2稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法
平板菌落計(jì)數(shù)法是以適當(dāng)倍數(shù)稀釋所測(cè)樣品液至其中微生物分散成單個(gè)細(xì)胞，然后通過在適宜生長條件下固體培養(yǎng)基上形成單個(gè)菌落的數(shù)目來測(cè)定微生物數(shù)量的方法。在實(shí)際操作中，首先需要將樣品液經(jīng)過梯度稀釋后取一定量均勻涂布在固體培養(yǎng)基上給予合適的生長條件倒置培養(yǎng)固定時(shí)間，最后對(duì)平皿上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。此方法最重要的步驟是稀釋，選取合適的稀釋倍數(shù)可以減小誤差提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。一般而言，在稀釋過后，每個(gè)平皿中細(xì)菌、放線菌、酵母菌的菌落數(shù)在30～300個(gè)范圍內(nèi)，霉菌的菌落數(shù)在10～100個(gè)范圍內(nèi)。李華通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化還原染料TTC或章納氏綠可使細(xì)菌與培養(yǎng)基間顏色對(duì)比鮮明，并有輕微的抑菌現(xiàn)象，使得各菌落的邊緣明顯，很少出現(xiàn)菌落交叉的現(xiàn)象，更適宜于觀察計(jì)數(shù)[4]。由于該方法針對(duì)活菌計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度高這一特點(diǎn)，通常使用其它方法測(cè)定生長曲線時(shí)以該方法作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。
1.3稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法
稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法也稱為最大概率法，其原理為數(shù)學(xué)概率統(tǒng)計(jì)法。首先需要對(duì)菌液進(jìn)行十倍系列梯度稀釋，直到稀釋液接種到培養(yǎng)基上不出現(xiàn)或極少出現(xiàn)細(xì)菌生長，以出現(xiàn)生長的最低稀釋度與沒有出現(xiàn)生長的最高稀釋度為基礎(chǔ)，憑借“或然率”理論計(jì)算單位體積樣品中近似菌數(shù)。一般每個(gè)稀釋度的重復(fù)接種管數(shù)為3管，接種后需繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)段，之后確定三位數(shù)字的數(shù)量指標(biāo)（原則為：最高稀釋度中重復(fù)試管全部長菌的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)的第一個(gè)數(shù)字；再取后面兩個(gè)稀釋度中長菌的管數(shù)，作為余下的兩個(gè)數(shù)字）。根據(jù)數(shù)量指標(biāo)可從最大可能數(shù)表中查到最大可能細(xì)菌數(shù)從而確定生長量。
1.4比濁法
比濁法測(cè)定生長量的原理是以細(xì)菌懸浮液的生物量與懸浮液的混濁程度成正比為基礎(chǔ)，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定的OD600值間接推斷樣品中微生物總量。實(shí)驗(yàn)過程大致為：（1）細(xì)菌樣品的接種培養(yǎng)：接同樣量的菌種子液于2-3瓶液體培養(yǎng)基中，并設(shè)置一空白樣。之后將空白樣和樣品一同放置搖培箱進(jìn)行培養(yǎng)。（2）測(cè)定OD值：設(shè)置儀器波長為600nm，以CK作為對(duì)照測(cè)定樣品不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液OD600值，若菌懸液濃度過大，需稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使OD值在0.1～0.8，并記錄培養(yǎng)時(shí)間、稀釋倍數(shù)和OD600值[5]。朱艷蕾在對(duì)細(xì)菌生長曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法的研究表明，產(chǎn)紅色素菌株AY9因?yàn)榧t色代謝物的積累導(dǎo)致生長曲線不但沒有出現(xiàn)衰亡期，反而出現(xiàn)穩(wěn)定期后又有增長趨勢(shì)[6]，這說明代謝物顏色過深會(huì)嚴(yán)重影響吸光度。雖然比濁法省時(shí)省力，但是其原理并不適用于所有細(xì)菌，謝三磊等在對(duì)副雞禽桿菌A、B、C三個(gè)血清型參考菌株的研究中發(fā)現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)定期，菌液OD600值和活菌數(shù)之間并非線性關(guān)系，而是比較復(fù)雜的一元二次多項(xiàng)式回歸關(guān)系[7]。
1.5幾種數(shù)量測(cè)定方法的比較
2、微生物重量測(cè)定方法
微生物重量測(cè)定方法使用稱重法。稱重法是直接將菌體經(jīng)過一定的處理后稱取干重，以重量的變化來反映微生物生長量大小的方法。該方法普遍適用于放線菌與真菌，由于這兩種菌屬個(gè)體、形態(tài)、生長周期等特點(diǎn)與細(xì)菌相差較大，所以常用的細(xì)菌生長量測(cè)定方法不適用于這兩者。大體步驟為：每個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)2～3個(gè)平行，在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出菌液進(jìn)行離心后將菌絲體洗滌干凈（洗滌次數(shù)可為1～2次），之后再次離心、105℃烘干沉淀物至兩次重量無差別，最后計(jì)算出平行試驗(yàn)的平均數(shù)即可。稱重法原理簡單但是操作復(fù)雜、干燥時(shí)間長、過程中造成的誤差較大并且在實(shí)際生長曲線測(cè)定中很難確定樣品何時(shí)進(jìn)入衰亡期。
3、群體生理指標(biāo)測(cè)定方法
3.1含氮量測(cè)定法
氮是蛋白質(zhì)中穩(wěn)定的主要成分，且微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量很穩(wěn)定。利用凱氏定氮法理論基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)中的含氮量通常占其總質(zhì)量的16%左右，而微生物中蛋白質(zhì)含量又平均占細(xì)胞總質(zhì)量的68%左右。在測(cè)得菌體含氮量后再算得蛋白質(zhì)的總量之后進(jìn)一步確定樣品細(xì)胞的總質(zhì)量即可確定其生長量[9]。大致步驟為：在有加速劑的條件下，用濃硫酸消化樣品經(jīng)過高溫分解反應(yīng)將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成銨鹽，堿化后隨水蒸氣蒸餾出來的氨被過量的硼酸吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定，就可計(jì)算出樣品中的全氮含量，以全氮含量間接反映生長量的大小。當(dāng)然，其它氮素測(cè)定法也可根據(jù)具體情況選擇性使用。
3.2底物消耗法
碳源是微生物生長過程中必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，以葡萄糖為例，我們可以根據(jù)樣品微生物消耗的葡萄糖量來確定其生長狀況。采用DNS法測(cè)定培養(yǎng)液中殘留的葡萄糖含量，首先使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制工作曲線樣液，在540nm波長下測(cè)定吸光度，得到工作曲線方程。將離心后的樣品上清液進(jìn)行稀釋相應(yīng)倍數(shù)，取部分于試管中，加入DNS試劑后用蒸餾水定容，測(cè)定其吸光度后求得上清液中葡萄糖含量。李鴻梅等在對(duì)羅耳阿太菌的生長曲線的測(cè)定研究中發(fā)現(xiàn)底物消耗法與稱重法所測(cè)得的羅耳阿太菌的生長曲線都可以準(zhǔn)確地顯示出延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期的時(shí)間點(diǎn)，且相比之下，底物葡萄糖消耗法操作更加簡單、數(shù)值更準(zhǔn)確、更適合大型工業(yè)生產(chǎn)[10]。除了葡萄糖外，微生物生長過程中還需很多消耗物，實(shí)驗(yàn)者還可根據(jù)不同微生物特點(diǎn)從五大營養(yǎng)物質(zhì)碳源、氮源、礦質(zhì)元素、水、生長因子著手。
3.3生物活性法
目前世界上半數(shù)以上的抗生素都是放線菌產(chǎn)生的。所以依據(jù)其代謝物的抑菌效果，可以通過投放放線菌的目標(biāo)作用菌于固體培養(yǎng)基中，在固定的時(shí)間測(cè)定抑菌圈的直徑大小間接反映放線菌的生長量的大小。張紅丹等在放線菌769生長曲線的測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)用測(cè)抑菌圈直徑法、比濁法、稱取菌絲體干重法測(cè)定的放線菌769生長曲線和生物活性，變化趨勢(shì)基本一致，證明了抑菌圈直徑法的有效性[11]。該方法的適用條件較為局限，試驗(yàn)前需要知道樣品菌種對(duì)哪種微生物的生長有抑制作用。
4、結(jié)語
基于微生物生長曲線下生長量的測(cè)定對(duì)于實(shí)驗(yàn)室微生物的深入研究與工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要作用。測(cè)定微生物生長量并不局限于本文所列出的方法，但是從使用率與準(zhǔn)確率來看，上述方法都是很實(shí)用的。單細(xì)胞細(xì)菌多使用數(shù)量測(cè)定法，在細(xì)菌不帶深色且代謝產(chǎn)物影響較小的情況下又多使用比濁法。一般在使用除平板菌落計(jì)數(shù)法外的另外三種數(shù)量測(cè)定法所得結(jié)果都需要與平板菌落計(jì)數(shù)法的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析來提高生長曲線的準(zhǔn)確度。放線菌與真菌不常使用數(shù)量測(cè)定法（如放線菌菌絲較少較小也可以用OD法，不過誤差比較大），測(cè)定多以重量測(cè)定法為主，以群體生理指標(biāo)測(cè)定為輔。不管怎樣，要根據(jù)實(shí)際情況與微生物的特征選擇最合適的生長量測(cè)定方法來確定生長曲線。
參考文獻(xiàn):
[1]沈萍，陳向東.微生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社，2006:135-136.
[2]韓翠翠.例析顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和稀釋涂布平板法[J].實(shí)驗(yàn)教學(xué)與儀器，2016，33(1):32-34.
[3]張霞.微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的點(diǎn)滴改進(jìn)[J].生物學(xué)通報(bào)，1998(1):27.
[4]李華.平板菌落計(jì)數(shù)的改進(jìn)方法[J].生物學(xué)通報(bào)，2006(1):51.
[5]李麗，楊澤賢，王素霞，等.產(chǎn)氨短桿菌生長曲線的測(cè)定[J].飼料研究，2015(1):71-73.
[6]朱艷蕾.細(xì)菌生長曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法的研究[J].微生物學(xué)雜志，2016，36(5):108-112.
[7]謝三磊.副雞禽桿菌A、B、C三個(gè)血清型參考菌株生長曲線的測(cè)定和比較[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第八屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2013:4.
[8]楊茜.石油烴降解菌的篩選及石油污染土壤的生物修復(fù)機(jī)理研究[D].西安建筑科技大學(xué)，2014.
[9]莫繼先，王志剛，王昌河.常見微生物數(shù)量測(cè)定方法比較[J].生物學(xué)教學(xué)，2012，37(1):42-43.
[10]李鴻梅，苗琇巖，魏明，等.羅耳阿太菌的鑒定及生長曲線的測(cè)定[J].食品科技，2014，39(6):35-39.
[11]張紅丹，杜茜，張正坤，等.放線菌769抑菌譜及液體培養(yǎng)生長曲線的測(cè)定[J].中國植保導(dǎo)刊，2010，30(7):5-9.
陳玉琪.微生物生長曲線中生長量測(cè)定方法的比較[J].輕工科技，2020，36(04):7-8+12.
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