研究簡介：枯草芽孢桿菌是一種廣泛存在于環(huán)境中的產(chǎn)孢細(xì)菌，其孢子對多種脅迫具有極強(qiáng)的抵抗力，包括熱處理、紫外線處理等。這些孢子在食品中并無危害，除非提供適宜的發(fā)芽和生長環(huán)境。因此，有效滅活細(xì)菌孢子或抑制孢子發(fā)芽及后續(xù)營養(yǎng)生長的保存方法在食品工業(yè)中具有潛在應(yīng)用價值。研究人員使用了枯草芽孢桿菌DSM 10菌株，通過特定的培養(yǎng)和處理方法，制備了不同總密度和可培養(yǎng)密度的混合孢子群體。使用臺式SBS-XeMaticA-(L+L)設(shè)備進(jìn)行PL處理，該設(shè)備能夠發(fā)射短時高功率的寬帶光，其中約40%為紫外光區(qū)域。PL處理的總光量范圍為0.14–12 J/cm2，通過能量計測量單脈沖光量，并計算總光量。微生物分析通過平板計數(shù)法進(jìn)行，孢子發(fā)芽與營養(yǎng)生長分析通過測量600 nm吸光度（OD600）監(jiān)測。本研究主要評估脈沖光（Pulsed Light,PL）處理對枯草芽孢桿菌孢子發(fā)芽及后續(xù)營養(yǎng)生長的影響，以及PL處理與熱處理的協(xié)同效應(yīng)。研究結(jié)果表明，PL處理對枯草芽孢桿菌孢子的發(fā)芽和營養(yǎng)生長有顯著影響，且與熱處理有協(xié)同作用，為食品工業(yè)中的微生物控制提供了新的方法。
Bioscreen C全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C全自動生長曲線分析儀被用于監(jiān)測枯草芽孢桿菌孢子發(fā)芽及后續(xù)營養(yǎng)生長的過程。將300μL的枯草芽孢桿菌孢子懸液加入到300μL的胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中，初始OD600設(shè)置為1.0。將混合液加入到Bioscreen C的微孔板中，微孔板在30℃下培養(yǎng)48小時。每5分鐘自動監(jiān)測一次OD600，每次測量前微孔板會搖動10秒，以防止孢子沉降。每種條件和陰性對照設(shè)三個重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，以確保數(shù)據(jù)的可靠性。通過Bioscreen C記錄的OD600數(shù)據(jù)，可以分析孢子發(fā)芽及后續(xù)營養(yǎng)生長的動力學(xué)變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本研究首次描述了PL處理對發(fā)芽動力學(xué)及后續(xù)營養(yǎng)生長的影響。僅高強(qiáng)度處理完全抑制了枯草芽孢桿菌孢子發(fā)芽和后續(xù)生長。較低總光量(0.3–5.5 J/cm2)對發(fā)芽影響輕微或無影響，但延遲了營養(yǎng)生長，可能延長液態(tài)食品或表面去污固態(tài)食品的保質(zhì)期。誘導(dǎo)生長延遲(更長滯后期)的PL處理降低了枯草芽孢桿菌孢子的耐熱性，表明該聯(lián)合處理具有潛在應(yīng)用價值。若此結(jié)論適用于其他復(fù)雜基質(zhì)和微生物，該聯(lián)合工藝可用于有效去污光穿透有限的復(fù)雜產(chǎn)品。與熱處理類似，枯草芽孢桿菌細(xì)胞對PL的敏感性在孢子發(fā)芽及后續(xù)營養(yǎng)生長過程中變化。一旦孢子發(fā)芽，細(xì)胞在指數(shù)生長期和穩(wěn)定期對PL或熱處理的敏感性相同。盡管需進(jìn)一步研究PL預(yù)處理誘導(dǎo)的熱敏感性增強(qiáng)的持續(xù)性，但本研究結(jié)果證明了PL技術(shù)作為傳統(tǒng)方法替代方案的潛力，可降低枯草芽孢桿菌在水和營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中的發(fā)育可能性。
圖1、PL處理對枯草芽孢桿菌萌發(fā)和無性生長的影響。黑線為未處理孢子，灰線為0.3 J/cm2的PL處理孢子，黑虛線為1 J/cm2的PL處理孢子，灰虛線為2 J/cm2的PL處理孢子，黑虛線為5.5 J/cm2的PL處理孢子，灰虛線為12 J/cm2的PL處理孢子。數(shù)據(jù)點(diǎn)為至少三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值
圖2、在總細(xì)胞密度和可存活細(xì)胞密度相同的情況下，比較經(jīng)PL處理(連續(xù)線)或由死細(xì)胞和活細(xì)胞混合組成(不連續(xù)線)的枯草芽孢桿菌懸浮液的萌發(fā)和無性生長情況。對總細(xì)胞數(shù)為108個/毫升的細(xì)胞群和不同的可培養(yǎng)細(xì)胞密度進(jìn)行了評估：106(a)、104(b)或102個細(xì)胞/毫升(c)。數(shù)據(jù)點(diǎn)為至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖3、在30℃的TSB中培養(yǎng)期間枯草芽孢桿菌的可培養(yǎng)性。未處理孢子的開圓圈、以0.3J/cm2處理的填充圓圈孢子PL、以1J/cm2處理的填充上三角孢子PL、密度為106個細(xì)胞/毫升的開口上三角孢子、以2J/cm2處理的填充正方形孢子PL、密度為104個細(xì)胞/毫升的開口正方形孢子、以5.5J/cm2處理的填充菱形孢子PL、密度為102個細(xì)胞/毫升的開口菱形孢子、以12J/cm2處理的星號孢子PL。誤差條表示95%置信區(qū)間，連續(xù)線表示檢測限。
圖4、在30℃的TSB中培養(yǎng)期間枯草芽孢桿菌細(xì)胞的熱敏感性。未處理孢子的開圓圈、以0.3J/cm2處理的填充圓圈孢子PL、以1J/cm2處理的填充上三角孢子PL、密度為106個細(xì)胞/毫升的開口上三角孢子、以2J/cm2處理的填充正方形孢子PL、密度為104個細(xì)胞/毫升的開口正方形孢子、以5.5J/cm2處理的填充菱形孢子PL、密度為102個細(xì)胞/毫升的開口菱形孢子、以12J/cm2處理的星號孢子PL。誤差條表示95%置信區(qū)間。連續(xù)線表示檢測極限。
圖5、30℃下發(fā)芽期間不同時間間隔PL處理對枯草芽孢桿菌可培養(yǎng)性的影響。誤差條表示95%置信區(qū)間。
總結(jié)
研究人員通過脈沖光(PL)處理后，評估了枯草芽孢桿菌的細(xì)胞可培養(yǎng)性(孢子計數(shù))損失、孢子發(fā)芽及隨后的營養(yǎng)生長。PL對這些機(jī)制的影響取決于施加的總光量，隨著總光量(0.3–12 J/cm2)的增加，孢子計數(shù)減少。低總光量(0.3 J/cm2)處理后，孢子發(fā)芽和營養(yǎng)生長均未受影響。1至2 J/cm2的光量未改變發(fā)芽速率，但顯著延遲了細(xì)菌生長。生長前的滯后期隨總光量的增加而延長。對于更高的總光量(5.5 J/cm2)，孢子發(fā)芽速率顯著降低。當(dāng)枯草芽孢桿菌孢子受到12 J/cm2的處理時，未檢測到可培養(yǎng)細(xì)胞(達(dá)到細(xì)胞滅活的最大可檢測水平)，孢子發(fā)芽和營養(yǎng)生長均被抑制至少48小時。在發(fā)生發(fā)芽的PL處理中，除最低光量(0.5 J/cm2)外，枯草芽孢桿菌細(xì)胞在發(fā)芽早期對PL的抵抗力暫時增強(qiáng)。此后，細(xì)胞變得更敏感，在指數(shù)生長期和穩(wěn)定期對PL的抵抗力相似。PL使枯草芽孢桿菌細(xì)胞(孢子或營養(yǎng)形態(tài))對后續(xù)熱處理敏感，證明了熱與PL的協(xié)同效應(yīng)，這種聯(lián)合處理在微生物滅活中具有潛在應(yīng)用價值。Bioscreen C全自動生長曲線分析儀在本研究中發(fā)揮了重要作用，通過高精度和高重復(fù)性的OD600測量，提供了詳細(xì)的孢子發(fā)芽和營養(yǎng)生長動力學(xué)數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)幫助評估了PL處理對枯草芽孢桿菌孢子發(fā)芽及后續(xù)營養(yǎng)生長的影響，為食品工業(yè)中的微生物控制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究提供了PL處理對枯草芽孢桿菌孢子發(fā)芽及后續(xù)營養(yǎng)生長影響的詳細(xì)分析，以及PL處理與熱處理的協(xié)同效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)對于食品工業(yè)中的微生物控制具有重要意義，可能有助于開發(fā)更有效的非熱處理技術(shù)，以提高食品的穩(wěn)定性和安全性。
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