3．缺失株ΔvgrG的構(gòu)建：
根據(jù)NCBI公布的Kpn vgrG ORF序列(NCBI Reference Sequence:NC_016845.1)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR分別擴(kuò)增vgrG上下游同源臂序列，再經(jīng)過(guò)融合PCR擴(kuò)增同源臂融合片段。回收純化后的同源臂融合片段和質(zhì)粒pKO3-Km分別用限制性內(nèi)切酶NotⅠ進(jìn)行酶切，再用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定并測(cè)序正確。重組質(zhì)粒pKO3-Km-vgrG轉(zhuǎn)化入Kpn感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)同源重組整合，篩選出構(gòu)建成功的缺失株KpnΔvgrG。引物序列見表1，引物由蘇州金唯智生物科技合成。
4．回補(bǔ)株CΔvgrG的構(gòu)建：
根據(jù)NCBI的Kpn基因組序列擴(kuò)增得到vgrG啟動(dòng)子及其全基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ對(duì)質(zhì)粒pBAD33進(jìn)行雙酶切，將酶切后的載體與擴(kuò)增片段通過(guò)同源重組酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定并測(cè)序正確。將重組質(zhì)粒pBAD33-vgrG轉(zhuǎn)入ΔvgrG株感受態(tài)細(xì)胞，涂板37℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，經(jīng)PCR鑒定含有重組質(zhì)粒的菌株，即為回補(bǔ)株CΔvgrG。引物序列見表1，引物由蘇州金唯智生物科技合成。
5．生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)：
將野生株WT、ΔvgrG株和CΔvgrG株的單菌落分別接種于15 ml LB培養(yǎng)基中，37℃200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接至50 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔2 h測(cè)定菌液A 600值，連續(xù)檢測(cè)24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)3次。使用軟件GraphPad Prism 8.0繪制生長(zhǎng)曲線。
6．沉淀離心試驗(yàn)(黏度試驗(yàn))：
挑取平板菌落至LB液體培養(yǎng)基中(CΔvgrG株培養(yǎng)基加入1.5%阿拉伯糖)，37℃200 r/min培養(yǎng)至A 600值為2.0左右，5 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)后吸取上清測(cè)定A 600值，比較不同菌株上清的吸光度值以反映菌體黏度。
7．人肺上皮細(xì)胞A549黏附試驗(yàn)：
將2×10 5個(gè)A549細(xì)胞至24孔細(xì)胞板，貼壁后將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的新鮮Kpn菌液按照MOI＝20感染細(xì)胞5 h，PBS洗3次，0.5%Triton X-100裂解細(xì)胞，裂解液于LB平板培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)黏附的細(xì)菌克隆數(shù)。
8．小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7吞噬試驗(yàn)：
將Raw264.7細(xì)胞鋪于12孔細(xì)胞板，細(xì)胞密度為5×10 5個(gè)/ml。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株菌液按照MOI＝20感染細(xì)胞，感染2 h后更換為含100μg/ml慶大霉素的DMEM培養(yǎng)1 h殺滅胞外菌，最后更換為含10μg/ml慶大霉素的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)6 h和12 h，0.5%Triton X-100裂解細(xì)胞，裂解液于LB平板培養(yǎng)，即為胞內(nèi)存活的細(xì)菌克隆數(shù)。
9．小鼠存活率試驗(yàn)：
Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株以致死劑量1×10 8 CFU經(jīng)鼻腔注射感染小鼠。感染后連續(xù)觀察10 d，統(tǒng)計(jì)存活率。
10．小鼠臟器細(xì)菌載量試驗(yàn)：
Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株以半致死劑量(5×10 7 CFU)經(jīng)鼻腔注射感染小鼠，感染后第3天收集肺臟并研磨，懸液中細(xì)菌通過(guò)倍比稀釋進(jìn)行計(jì)數(shù)。
11．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：
應(yīng)用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，采用線性回歸進(jìn)行相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
1．成功構(gòu)建ΔvgrG株和CΔvgrG株：
以高保真酶PCR擴(kuò)增出vgrG的上游同源臂和下游同源臂，大小均為524 bp，拼接后連接至自殺載體。自殺載體pKO3-Km-vgrG導(dǎo)入Kpn WT株，經(jīng)同源重組整合，獲得了敲除vgrG的無(wú)痕缺失株。經(jīng)特異性引物鑒定，WT株中存在vgrG而缺失株中無(wú)法擴(kuò)增出vgrG序列(圖1)。再以高保真酶PCR擴(kuò)增出vgrG的啟動(dòng)子區(qū)域及完整開放閱讀框，大小為3 039 bp，連接至表達(dá)載體pBAD33。將pBAD33-vgrG導(dǎo)入ΔvgrG感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)特異性引物鑒定，CΔvgrG株構(gòu)建成功(圖2)。
vgrG同源臂擴(kuò)增與ΔvgrG株P(guān)CR鑒定
注：M：DL2000 marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：上下游同源臂；4：pKO3-Km-vgrG載體鑒定；5：陰性對(duì)照；6：WT株；7：ΔvgrG株；8：陰性對(duì)照
vgrG序列擴(kuò)增與CΔvgrG株P(guān)CR鑒定
注：M：DL2000 marker；1：vgrG PCR擴(kuò)增序列；2：pBAD33-vgrG載體鑒定；3：陰性對(duì)照；4：WT株；5：ΔvgrG株；6：CΔvgrG株；7：陰性對(duì)照
2．vgrG基因缺失后細(xì)菌的體外生長(zhǎng)能力測(cè)定：
為觀察vgrG是否對(duì)體外生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，每2 h用酶標(biāo)儀測(cè)定不同菌株在LB培養(yǎng)基中的A 600值，測(cè)至細(xì)菌生長(zhǎng)平臺(tái)期。結(jié)果顯示無(wú)論在對(duì)數(shù)期(4~8 h)還是最終的平臺(tái)期(12 h以后)，WT株和ΔvgrG株生長(zhǎng)速度沒(méi)有顯著區(qū)別[(1.40±0.10)vs(1.20±0.30)，t＝0.63，P>0.05]，ΔvgrG株和CΔvgrG株之間也沒(méi)有顯著區(qū)別(P>0.05)。以上結(jié)果表明vgrG不參與細(xì)菌的體外生長(zhǎng)(圖3A)。
細(xì)菌體外生長(zhǎng)曲線與黏度測(cè)定
注：A：細(xì)菌體外生長(zhǎng)曲線；B：細(xì)菌離心后上清液吸光度(A)值
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