1.2.7噬菌體紫外線敏感性測定
取噬菌體原液2 mL于直徑9 cm無菌培養(yǎng)皿中，置于超凈工作臺紫外燈下30 cm照射，間隔5 min取樣，采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價，所有試驗均重復3次。
1.2.8噬菌體裂解譜測定
測定菌株包括13株枯草芽孢桿菌、5株莫哈韋芽孢桿菌、1株蠟樣芽孢桿菌及1株地衣芽孢桿菌，為實驗室現有菌種庫保存。復蘇菌株后挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)4 h至對數期，取100μL對數期菌液與50℃LB半固體培養(yǎng)基混合制備雙層板，上層凝固后在雙層平板中央滴加10μL噬菌體(108 PFU/mL)懸液。37℃溫箱培養(yǎng)6 h觀察是否出現噬菌斑。
1.2.9噬菌體體外裂解試驗
將噬菌體富集液10倍比稀釋，濃度依次為108 PFU/mL、107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL、104 PFU/mL。分別取不同濃度的噬菌體稀釋液100μL加入96孔板，再向每孔中加入100μL濃度為107 CFU/mL的宿主菌液，每個梯度做3個平行，以200μL菌液作為陽性對照，以200μL LB液作為陰性對照。使用動態(tài)酶標儀，測定其OD600值，每隔1 h測定一次，共測定24 h。
1.2.10抗性菌株篩選
挑取噬菌體裂解的菌株單菌落LB液體培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數期后按最佳MOI比例加入噬菌體，37℃180 r/min培養(yǎng)至澄清后，取1 mL裂解液轉接至對數期宿主菌菌液中共培養(yǎng)，如此重復多次直至培養(yǎng)液出現渾濁后，使用接種棒涂布于LB固體平板，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落使用點斑法進行裂解試驗，直到篩選出噬菌體不能裂解且穩(wěn)定的抗性菌株。
1.2.11抗性菌株生長動力學監(jiān)測
將抗性菌株與原始菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)6 h作為種子液。將其接種至96孔板，100μL菌液與100μL LB液體培養(yǎng)基，使用酶標儀于37℃培養(yǎng)并測定OD600，每隔1 h測定一次，測定48次，設置3個重復。
1.2.12抗性菌株發(fā)酵效價測定
同1.2.11培養(yǎng)種子液，按2%接種量轉接至新鮮LB培養(yǎng)基進行搖菌發(fā)酵，每隔12 h取樣測定效價，測定4次。效價測定采用稀釋涂布法，使用LB液進行梯度稀釋，吸取菌液100μL涂布LB固體平板，每個稀釋度設置3個重復，37℃倒置培養(yǎng)12 h后計數菌落形成單位(CFU/mL)。
1.2.13淀粉酶活性測定
采用DNS法測定α-淀粉酶活力，使用LB液體培養(yǎng)基進行菌株發(fā)酵，測定8 h、12 h、24 h、36 h、48 h淀粉酶活性。取發(fā)酵液10 000×g離心6 min，取上清液進行檢測。使用α-淀粉酶試劑盒進行淀粉酶活性測定。使用試劑處理后，OD540讀取光密度值并代入標準曲線方程進行計算。
2結果
2.1噬菌體PJNB028形態(tài)
枯草芽孢桿菌噬菌體命名為PJNB028。如圖1所示，噬菌斑近圓形，邊緣有暈環(huán)，直徑約2 mm。
圖1噬菌體PJNB028噬菌斑形態(tài)
2.2噬菌體PJNB028全基因組分析
噬菌體PJNB028基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，全長162 308 bp，G+C含量為34%。全基因組BLASTN比對結果表明，噬菌體PJNB028與枯草芽孢桿菌噬菌體Bacillus phage 2S-4相似度最高為100%。經CARD網站預測PJNB028基因組中未發(fā)現耐藥基因、毒力基因。全基因組序列已提交至國家微生物科學數據中心(National Microbiology Data Center，NMDC)，編號NMDC60203838。
如圖2所示，PJNB028具有237個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，含有13個tRNA基因(表1)，66個ORF編碼為已知功能蛋白質。其中已知功能閱讀框分為5個功能模塊:裂解、復制、結構與包裝、轉錄調控和未知模塊。2個ORF與裂解相關，30個ORF與DNA復制修復相關，18個ORF是結構與包裝蛋白，16個ORF與轉錄調控相關，其余為假定蛋白(hypothetical protein)。在ORF160和ORF161之間編碼了tRNA-Arg、tRNA-Arg、tRNA-Gly、tRNA-Ser、tRNA-Ser、tRNA-Thr、tRNA-Leu、tRNA-Cys和tRNA-Met，在ORF161和ORF162之間編碼了tRNA-Pro、tRNA-Glu、tRNA-Gly和tRNA-Asn。
圖2噬菌體PJNB028基因組圈圖
表1噬菌體PJNB028基因組中的tRNA基因
其中，與裂解相關的ORF131為穿孔素，作用于細菌細胞膜，是一種疏水性跨膜蛋白。ORF133預測為LysM肽聚糖結合域蛋白，可能與細菌細胞壁的識別和相互作用有關，兩者相互配合聯合抑菌。18個ORF與蛋白質的結構和包裝有關，ORF138(phage tail spike protein)結合多糖特定細菌宿主，有助于決定噬菌體侵染的專一性;ORF140(phage tail domain-containing protein)為噬菌體的尾部結構;ORF141(phage tail tape measure protein)用于測量噬菌體尾部長度，控制尾部長度，有助于噬菌體識別和結合宿主細菌。ORF157預測為末端酶大亞基，末端酶對啟動DNA包裝至關重要。30個ORF與DNA復制相關，PJNB028編碼了許多與核酸修飾有關的蛋白質，如ORF86DNA拓撲異構酶、ORF104DNA連接酶、ORF128交叉連接內脫氧核糖核酸酶RuvC等。通過NCBI結構域預測發(fā)現ORF86是四型拓撲異構酶。ORF33預測為含有DNA樣解旋酶C端結構域的蛋白質，與DNA的復制和修復有關。ORF142(site-specific integrase)是一種位點特異性重組酶，能夠在特定DNA序列之間進行重組。16個ORF與轉錄調控相關。ORF175(helix-turn-helix domain-containing protein)是含有螺旋-轉角-螺旋結構域的蛋白質，有研究表明該蛋白質可用于調控CRISPR系統(tǒng)。ORF202(Rho termination factor N-terminal domain-containing protein)主要與轉錄終止調控相關。ORF221(type II toxin-antitoxin system HicB family antitoxin)II型毒素-抗毒素系統(tǒng)是一種廣泛存在于細菌和古菌中的遺傳系統(tǒng)，有利于噬菌體PJNB028在細菌細胞內生存。
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