鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又稱鴨瘟病毒，可引起鴨病毒性腸炎，是一種泛嗜性全身性感染的病毒，也是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的病原之一。該病毒對不同品種、年齡的鴨均可致病。患病鴨臨床表現(xiàn)為急性敗血癥過程，其特征是血管損傷，體腔溢血，消化道出血、炎癥和壞死等。
DEV屬于皰疹病毒科馬立克病毒屬，具有基因組大、非必需基因多、遺傳穩(wěn)定性好等特性。這些特性使DEV作為病毒載體成為可能。以DEV為載體，已成功表達了小鵝瘟病毒VP2基因、新城疫病毒F基因、H5N1型高致病性禽流感病毒HA基因。在DEV基因組中插入報告基因可快速高效地篩選重組病毒。目前常用綠色熒光蛋白(GFP)、增強型綠色熒光蛋白(EGFP)、紅色熒光蛋白(RFP)以及β-半乳糖苷酶基因(LacZ)標(biāo)記重組病毒。
孫瑩等通過同源重組將GFP表達盒插入DEV UL2基因，篩選并純化了表達綠色熒光蛋白的UL2基因缺失的重組DEV。但研究發(fā)現(xiàn)GFP在DEV中不能穩(wěn)定表達，隨著重組病毒的不斷傳代，GFP會發(fā)生點突變或缺失，因此有必要篩選更加穩(wěn)定的報告基團。
本研究將帶有RFP的UL2基因缺失轉(zhuǎn)移載體pT-UL2-RFP與DEV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)，經(jīng)過5輪蝕斑篩選、純化，獲得表達RFP的重組DEV，通過測定重組病毒及其親本毒的一步生長曲線以及用PCR測定不同代次重組病毒的RFP序列，以期獲得更穩(wěn)定的報告基因，為后期重組病毒的篩選奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自北京NEB公司；Ex Taq DNA聚合酶購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清、M199培養(yǎng)液購自Hyclone公司；OPTI-MEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；7.5%NaHCO3購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。
1.1.2菌(毒)株與細胞DEV細胞適應(yīng)毒以及重組質(zhì)粒pT-UL2-GFP-gpt、pT-RFP由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏與檢測室構(gòu)建、保存；DH5α受體菌購自天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.3 SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。
1.1.4鑒定引物ORFC17F：5’-ATGGCCGACG-ATAGGCT-3’，ORFC17R：5’-TTATACTGTTCCACAAGG-3’，由賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成。
1.2試驗方法
1.2.1重組質(zhì)粒pT-UL2-RFP構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-UL2-GFP-gpt用限制性內(nèi)切酶NheI-HF、BamH I-HF雙酶切，切除重組質(zhì)粒GFP-gpt表達盒，回收6.2 kb片段，質(zhì)粒pT-RFPNX用限制性內(nèi)切酶NheI-HF、BamH I-HF雙酶切，回收大小為711 bp RFP片段，通過T4 DNA連接酶將RFP替換GFP-gpt，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-UL2-RFP。
1.2.2重組病毒的制備、純化DEV細胞適應(yīng)毒接種CEF(MOI=0.01)，吸附1～2 h后，按Lipofectamine 3000說明書轉(zhuǎn)染高純度質(zhì)粒pT-UL2-RFP。轉(zhuǎn)染后72～96 h，觀察細胞病變情況，待80%細胞產(chǎn)生病變后，反復(fù)凍融3次，接種于新鮮CEF單層的六孔培養(yǎng)板中，用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養(yǎng)液覆蓋，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。觀察熒光，挑取單個有紅色熒光的蝕斑，在細胞上重復(fù)多次傳代，直至所有的蝕斑都帶有紅色熒光，確定為純化的重組病毒。
1.2.3重組病毒基因組
DNA的提取取重組DEV病毒液437.5μL，加入蛋白酶K(20 mg/mL)12.5μL，10%SDS 50μL；56℃水浴1 h；分別用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次；取上清，加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉和兩倍體積的無水乙醇，-20℃放置30 min；12000 g離心10 min，去除上清后，70%乙醇洗滌沉淀一次，沉淀溶于30μL去離子水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4重組病毒鑒定
重組病毒DNA用鑒定引物ORFC17F、ORFC17R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送北京華大基因生物公司測序。
1.2.5一步生長曲線
將重組病毒及其親本毒分別接種于8瓶25 cm2(MOI=0.01)的CEF中，接種后每隔12 h取出一瓶接毒細胞，收集細胞培養(yǎng)液上清作為上清樣品，再加入1 mL含有1%FBS的M199細胞維持液，凍融后取上清作為細胞樣品。將重組病毒及親本毒的病毒懸液做10倍系列稀釋，取4個適宜稀釋度，接種新鮮的CEF單層96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接0.1 mL，每個稀釋度接5孔，37℃吸附1 h后每孔加入0.1 mL細胞維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。觀察致細胞病變效應(yīng)(Cytopathic Effect，CPE)，記錄每個稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按Reed-Muench法計算病毒TCID50，并繪制一步生長曲線。
1.2.6重組病毒的穩(wěn)定性
將重組病毒接種CEF(MOI=0.01)，待80%細胞產(chǎn)生病變后，反復(fù)凍融3次，再接種CEF，按此方法連續(xù)傳代12次。熒光顯微鏡下觀察每代重組病毒的紅色熒光表達情況。按1.2.3方法提取第5代、第10代、第12代病毒DNA，用鑒定引物ORFC17F、ORFC17R通過PCR鑒定外源基因RFP是否穩(wěn)定存在。PCR產(chǎn)物送北京華大基因公司進行測序。
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