摘要腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)是水產(chǎn)品中特定腐敗菌之一。多肽-鋅螯合物具有抑菌潛力，但目前對(duì)其抑制腐生葡萄球菌的研究鮮有報(bào)道。該研究以鱖魚蛋白為底物，采用酶水解和螯合反應(yīng)，再經(jīng)“離心-醇沉法”和“醇沉-離心法”分別制備出鱖魚多肽-鋅螯合物P2和P3。采用牛津杯法和二倍梯度稀釋法研究P2和P3對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌圈和最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的影響;通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率、紫外物質(zhì)吸收、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活力，以及掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)等指標(biāo)和表征結(jié)果來(lái)綜合評(píng)價(jià)P2和P3對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌效果。結(jié)果表明，P2和P3對(duì)腐生葡萄球菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑分別為(17.89±3.06)mm和(21.39±2.46)mm，MIC均為0.78 mg/mL;經(jīng)P2和P3作用后，菌體生長(zhǎng)受到抑制、細(xì)胞膜完整性被破壞、通透性隨之增加，細(xì)菌體內(nèi)SOD活力增加、CAT活力下降;SEM結(jié)果顯示，經(jīng)P2和P3處理后的菌體細(xì)胞表面粗糙褶皺、扭曲變形，菌體結(jié)構(gòu)受到破壞，最終導(dǎo)致菌體死亡。
水產(chǎn)品中水分含量高、營(yíng)養(yǎng)成分豐富，增加了其腐敗變質(zhì)的可能性。其中，微生物是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因之一。水產(chǎn)品在腐敗過(guò)程中微生物群組成持續(xù)變化，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，只有少數(shù)微生物占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致水產(chǎn)品品質(zhì)下降，這些細(xì)菌被稱為特定腐敗菌(specific spoilage organism，SSO)。腐生葡萄球菌是水產(chǎn)品特定腐敗菌之一。
鱖魚廣泛分布于我國(guó)各主要江河湖泊，是重要的名優(yōu)淡水魚之一。近年來(lái)，隨著飼料鱖魚養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，其價(jià)格大幅度下降。魚蛋白水解一直是蛋白質(zhì)高質(zhì)化利用的有效途徑之一，蛋白質(zhì)水解物還能夠與金屬離子螯合制備具有重要功能特性的多肽-金屬螯合物，如鰱魚多肽-鋅，鱸魚多肽-鈣和羅非魚多肽-鋅等。
多肽-金屬螯合物是指肽與金屬離子之間通過(guò)多個(gè)配位體的螯合作用而形成的環(huán)狀化合物，具有促進(jìn)人體對(duì)礦物質(zhì)的吸收、抗氧化和抑菌保鮮作用。多肽-鋅螯合物是其中重要的一類，它的常規(guī)制備方法為醇沉-離心法，為許多研究者所采用，但是，WANG等采用離心-醇沉法和醇沉-離心法分別制備出P2和P3兩種多肽-鋅螯合物，一方面建立了一種新的制備方法，另一方面，也比較了2種螯合物性質(zhì)的差異，拓展了多肽與鋅螯合制備新技術(shù)。另外，針對(duì)其抑菌保鮮作用來(lái)說(shuō)，有研究報(bào)道，多肽-鋅螯合物具有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色假絲酵母的能力。本團(tuán)隊(duì)前期研究初步表明鱖魚蛋白源多肽-鋅螯合物具有水產(chǎn)保鮮效果，但是，針對(duì)其多肽-鋅螯合物抑制腐生葡萄球菌的機(jī)理尚不明確。
本實(shí)驗(yàn)以鱖魚蛋白為底物，采用風(fēng)味蛋白酶水解制備鱖魚蛋白水解物，將水解物與鋅離子螯合，再分別經(jīng)過(guò)離心-醇沉法和醇沉-離心法制備多肽-鋅螯合物(P1、P2和P3)。重點(diǎn)研究P2和P3對(duì)腐生葡萄球菌抑菌圈、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活力、生長(zhǎng)曲線的影響，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)以及細(xì)菌體內(nèi)最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)來(lái)揭示鱖魚多肽-鋅螯合物對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌機(jī)制，以期為多肽-金屬螯合物的抑菌機(jī)理提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
鱖魚(秋浦花鱖)，安徽省池州市東至縣大聯(lián)圩有限公司，質(zhì)量規(guī)格為0.5～0.6 kg;腐生葡萄球菌B8，作者所在課題組前期從腐敗鱖魚中分離、鑒定并保存的菌株;超氧化物歧化酶試劑盒、過(guò)氧化氫酶試劑盒，南京建成生物工程研究所;風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g)，諾維信生物公司;酵母粉、胰蛋白胨和瓊脂，生工生物工程(上海)股份有限公司;乙醚、氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇等(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
UV-5500紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司;FD-1 CE冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司;H 1750R離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;MJ-30D超聲波清洗機(jī)，長(zhǎng)沙明杰儀器有限公司;DDS-307A電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司。
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