1.2.6不同處理下的抑菌試驗
原液組:將分離純化后的N3-1①以1%接種量接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,在含5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600 nm值≥1.9),4℃下12 000×g離心15 min,收集上清液(即無菌發(fā)酵上清液),對上清液采用0.22μm濾膜無菌過濾,在-50℃條件冷凍干燥過夜。凍干后的固體用1 mL滅菌蒸餾水吹懸(濃縮至1/10體積),放置于-20℃冰箱中備用。采用1.2.5中所述牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗。
氫氧化鈉(NaOH)處理組:將分離純化后的N3-1①以1%接種量接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,在含5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600 nm值≥1.9),4℃下12 000×g離心15 min,收集上清液,用6 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6.5,以中和上清液中有機酸的干擾。后續(xù)步驟同上述原液組。
NaOH+CAT處理組:用pH為6.5的0.02 mol/L的醋酸鉀將CAT配成50 mg/mL的母液,在NaOH處理組所得無菌發(fā)酵上清液的基礎(chǔ)上,將母液加入到上清液中進(jìn)行10倍稀釋,使上清液中CAT的終濃度為5.0 mg/mL,37℃水浴2 h。后續(xù)步驟同上述原液組。
1.2.7不同pH乳酸抑菌試驗
將具有一定抑菌活性的分離乳酸菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①、屎腸球菌5號株按1%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中,在37℃培養(yǎng)24 h后,不經(jīng)過1/10體積濃縮,測定無菌發(fā)酵上清液的pH。用NaOH溶液將1/2的無菌發(fā)酵上清液調(diào)整至pH為6.5,另1/2不作處理。經(jīng)牛津杯法檢測上述2份無菌發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌ATCC29213株的抑菌作用。將乳酸溶液用無菌蒸餾水調(diào)整到pH分別為1.4、2.1、3.0、3.8,參照步驟1.2.5制備含有金黃色葡萄球菌ATCC29213株的0.7%TSA培養(yǎng)基平板,在對應(yīng)的牛津杯孔中分別加入上述不同pH的乳酸溶液100μL,37℃培養(yǎng)16 h,測量抑菌圈直徑,并計算抑菌物質(zhì)效價。
1.3數(shù)據(jù)處理與分析
采用Excel 2019整理數(shù)據(jù)并繪制圖片。采用CurveExpert 1.4漢化版軟件進(jìn)行線性方程的擬合。
2結(jié)果
2.1疑似乳酸菌16S rDNA測序鑒定
將從牛糞中分離的18株、從羊瘤胃內(nèi)容物中分離的9株和從青貯飼料中分離的2株共29株細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行擴增,擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1。將這29株分離菌株的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對,選取序列同源性最高的菌株作為測序菌株的疑似菌株,其中有11株疑似乳酸菌(表1)。
圖1 29株分離菌的16S rDNA擴增電泳圖
表1 29株分離菌的16S rDNA序列比對結(jié)果
2.2疑似乳酸菌的生長特性與產(chǎn)酸能力
如圖2所示,N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①均呈現(xiàn)白色黏液樣菌落,符合乳酸菌菌落的典型形態(tài)。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn),除N3-1①、N5-1①由于伊紅復(fù)染充分,顏色偏紅以外,N4-1①、N7-1①均呈藍(lán)色,顯微鏡下形態(tài)均呈短桿狀或棒狀球菌,直徑0.5~2.0μm,以單個或成對分布為主,部分成短鏈狀或成團狀分布。上述菌株革蘭氏染色均呈陽性,同時過氧化氫酶接觸顯示陰性,可初步確定為乳酸菌。
圖2 4株疑似乳酸菌的菌落及革蘭氏染色
由生長曲線(圖3)可知,N3-1①達(dá)到平臺期為16.15 h;N4-1①達(dá)到平臺期為16.53 h,在4株菌中最晚到達(dá)平臺期;N5-1①達(dá)到平臺期為15.77 h,在4株菌中最早到達(dá)平臺期;N7-1①達(dá)到平臺期為16.15 h,與N3-1①相同,表明這2株菌的生長特性比較接近。
圖3 4株疑似乳酸菌的生長曲線A:N3-1①28 h內(nèi)OD600 nm值變化;B:N4-1①28 h內(nèi)OD600 nm值變化;C:N5-1①28 h內(nèi)OD600 nm值變化;D:N7-1①28 h內(nèi)OD600 nm值變化。
產(chǎn)酸曲線(圖4)表明,N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①接種在MRS肉湯培養(yǎng)基中,0 h時pH均為6.2,培養(yǎng)24 h后,pH均在3.5左右,此時各菌株產(chǎn)酸能力已到達(dá)平臺期;繼續(xù)培養(yǎng)至36 h,pH沒有發(fā)生變化,表明乳酸菌生長達(dá)到穩(wěn)定期后,其產(chǎn)酸能力不再隨時間的延長而增加。
圖4 4株疑似乳酸菌的產(chǎn)酸曲線A:N3-1①36 h內(nèi)pH變化;B:N4-1①36 h內(nèi)pH變化;C:N5-1①36 h內(nèi)pH變化;D:N7-1①36 h內(nèi)pH變化。
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